基于微流控芯片的细胞低温保护剂的添加和去除过程研究

摘要

低温保存作为一项重要的技术，在细胞治疗、组织工程、再生医学、器官移植以及辅助生殖领域都有着极为广泛的应用。成功的低温保存不可避免的要使用到低温保护剂。但在添加和去除保护剂的过程中会引发渗透损伤、机械损伤，保护剂本身也会造成毒性损伤，导致细胞存活率降低。尤其是在玻璃化保存过程中，使用的保护剂浓度比较高，需要多次添加，从而导致更大的损伤，故优化保护剂的处理过程更为重要。因此，对于保护剂的添加和去除过程的研究有利于探索出最佳的方案，实现更好的保存效果。
　　本文针对保护剂的处理问题，主要进行了两方面的研究。首先针对小细胞悬浮液保护剂处理的问题，以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象，设计了流动聚焦型结构芯片。利用微通道内层流扩散原理，实现浓度的连续变化。并用荧光染液验证微通道的浓度分布情况。最后在三种不同的保护剂浓度下，比较传统分步法和芯片法的细胞存活率结果，分析了渗透损伤、毒性损伤以及离心损伤对细胞的影响。芯片法优化了保护剂的处理过程，不仅使得操作更加简便快速，而且极大的提高了细胞存活率。
　　另一方面，针对单个大细胞的保护剂处理问题，设计了另一套微流控芯片装置。通过有限元仿真和荧光染液的方法研究了浓度梯度生成结构的有效性。实验以受精失败的人卵细胞为研究对象，利用装置实现了卵细胞的捕获、细胞膜参数的测量，以及多浓度、多种类保护剂条件下细胞的体积响应观测。得到的数据为卵细胞添加和去除保护剂过程优化提供了理论依据，也为将来的人卵细胞研究提供了参考。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 低温保存技术的发展

1．1．2 低温保存常用的方法

1．1．3 低温保护剂的运用

1．2 添加和去除保护剂的研究现状

1．2．1 离心法

1．2．2 膜分离法

1．2．3 微流控法

1．3 本文研究内容与章节安排

1．3．1 研究内容

1．3．2 各章节安排

第二章 细胞膜传质理论模型和累积毒性模型

2．1 引言

2．2 细胞膜传质模型理论

2．2．1 K-K模型

2．2．2 2-P模型

2．3 毒性损伤模型

2．4 本章小结

第三章 小细胞悬浮液添加与去除保护剂过程优化

3．1 引言

3．2 保护剂添加与去除芯片

3．2．1 芯片设计

3．2．2 芯片加工

3．3 芯片微通道浓度验证

3．4 微流控芯片添加与去除保护剂实验

3．4．1 实验材料

3．4．2 实验平台

3．4．3 实验方法

3．4．4 检测方法

3．4．5 实验结果

3．5 讨论与总结

3．5．1 渗透性损伤

3．5．2 毒性损伤

3．5．3 离心损伤

3．6 本章小结

第四章 单个细胞添加与去除保护剂过程优化

4．1 引言

4．2 人卵母细胞灌流芯片

4．2．1 芯片设计

4．2．2 芯片加工

4．3 芯片仿真

4．3．1 模型建立

4．3．2 仿真结果

4．4 芯片浓度梯度验证

4．5 实验准备

4．5．1 实验材料

4．5．2 实验平台

4．5．3 实验方法

4．6 实验结果与讨论

4．6．1 实验数据与结果

4．6．2 应用与讨论

4．7 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的研究成果