新型化学发光纳米发光体的制备及其在急性心肌梗死标志物检测中的应用

摘要

论文首先综述了化学发光(CL)、CL纳米发光体、无标记CL体外诊断分析方法以及急性心肌梗死体外诊断的研究现状。指出CL分析法具有仪器简单、灵敏度高、线性范围宽等优点，已被广泛用于生物分析领域。其中，无标记CL分析技术由于具有简单、快速、灵敏的优势，已成为CL生物分析新的发展趋势。然而，目前所发展的无标记CL分析方法仍面临着灵敏度不够高、需要共反应试剂以及检测精准度不足等问题，这都大大制约了其在体外诊断分析中的应用。急性心肌梗死是目前较为常见的致死疾病之一，虽然在此方面的诊断技术有了一定的进步，但是死亡率依旧没有得到明显降低，最重要的原因是缺少有效的急性心肌梗死标志物快速灵敏检测方法。因此，发展简单、快速、成本较低的无标记分析方法对急性心肌梗死的快速诊断、治疗和预后具有重要的意义。
　　CL纳米发光体具有良好的生物兼容性、易于组装、高稳定性以及高效的发光效率等优点，非常适合用来构建纳米CL分析界面，进而发展新型高灵敏的无标记CL分析方法。因此，本论文围绕“新型化学发光纳米发光体的制备及其在急性心肌梗死标志物检测中的应用”这一主题，开展了一系列工作。首先合成了具有高效CL效率的三种吖啶酯功能化碳纳米发光体，发现其具有良好的化学发光和荧光特性，基于吖啶酯功能化碳纳米颗粒纳米发光体的CL和荧光性质构建了双模式检测阵列用于区分七种过渡金属离子;其次，合成了具有优异电化学发光(ECL)活性的半胱氨酸配位的铜离子和N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺双功能化的金纳米发光体/壳聚糖复合体以及具有内部催化和电位分辨ECL性质的纳米氧化石墨烯包裹二氧化钛的纳米发光体，并将其用于构建ECL纳米分析界面，分别实现了对急性心肌梗死标志物和肽素和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的快速、高灵敏以及精准检测。主要内容如下:
　　1、我们发展了一种简单、通用的方法，利用静电作用、π-π作用和酰胺键作用，将吖啶酯(AE)成功固载在三种碳纳米材料的表面，成功制备了吖啶酯功能化碳纳米颗粒(AE-CNPs)、氧化石墨烯(AE-GO)、多壁碳纳米管(AE-MCNTs)纳米发光体。通过计算得出其吸附在碳纳米颗粒、氧化石墨烯、多壁碳纳米管表面的吖啶酯含量分别为3.44×10-9、3.27×10-8、3.09×10-8mol/L。此外，在合成三种功能化纳米发光体时所需要的吖啶酯浓度为5.0×10-8mol/L，远低于合成其它发光功能化纳米发光体时所用的发光试剂浓度。研究表明，上述三种吖啶酯功能化碳纳米发光体均具有优异的CL活性和发光稳定性，且由于吸附在碳纳米颗粒、氧化石墨烯、多壁碳纳米管表面吖啶酯含量的差异，吖啶酯功能化碳纳米发光体的发光强度顺序为:AE-GO＞AE-MCNTs＞AE-CNPs。进一步，我们探究了其CL机理，发现碳纳米材料作为纳米尺寸反应平台，能够有效的促进电子的转移和OH·、O2·-的产生，因而产生了强的CL信号。本工作首次合成了具有优异CL特性的吖啶酯功能化纳米发光体。对比于没有功能化的吖啶酯，吖啶酯功能化的碳纳米发光体具有以下优势:(1)将发光试剂固载在材料表面对于发展无标记CL生物分析是必要的。因此，所制备的吖啶酯功能化碳纳米发光体或许可以用于构建无标记CL生物分析界面;(2)吖啶酯功能化碳纳米发光体富集了大量信号分子，可大大增强其CL信号。本工作提出的简单合成策略也可以拓展到其它吖啶酯功能化纳米发光体的制备。此外，合成的AE-CNPs也表现出了激发依赖的荧光性质和优异的抗光漂白稳定性。我们根据其优异的CL和荧光特性，成功构建了能够成功区分七种过渡金属离子的双模式检测阵列。
　　2、我们发展了一种由半胱氨酸配位的铜离子和N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺双功能化的金纳米发光体/壳聚糖复合体和免疫金纳米颗粒组成的发光免疫金纳米组装体，发现该发光免疫金纳米组装体修饰的氧化铟锡电极具有优异的ECL性质、免疫活性和良好的稳定性。在此基础上构建了一个检测急性心肌梗死标志物和肽素的无共反应试剂、无标记ECL免疫传感器。在和肽素存在下，由于多肽会阻碍电极上电子的转移而降低该传感器的ECL信号，根据降低的ECL信号值，可以实现和肽素从2.0×10-14到1.0×10-11mol/L范围内的测定，且其检测限为5.18×10-15mol/L，比基于商品化酶联免疫吸附分析试剂盒和CL双抗夹心模式的和肽素传感器至少低两个数量级。该传感器可以用于健康人血清样品中和肽素含量的测定，并且此传感器无需共反应试剂和复杂的标记步骤，因此它具有简单、快速、特异性高和成本低的优点。本工作表明发光免疫金纳米组装体是一种用于发展无共反应试剂和无标记的ECL免疫分析的理想纳米分析界面。该策略还可以用于检测其他具有相应抗体的目标物。此外，该无需共反应试剂的ECL免疫分析方法将在基于微流控器件、微芯片和印刷电极的ECL免疫分析领域具有重要的应用潜力。
　　3、利用水热法一步制备了纳米氧化石墨烯(nGO)包裹二氧化钛纳米颗粒(TiO2)的nGO@TiO2纳米发光体。研究发现，该纳米发光体在K2S2O8存在的中性水溶液中，通过一次负电位扫描即可得到两个电位分辨的ECL发射，在-1.27V和-1.85V峰电位下能够分别观察到位于510nm的ECL-1和位于535nm的ECL-2，且ECL-1和ECL-2分别来源于nGO@TiO2纳米发光中的TiO2和nGO部分。进一步地，通过对比ECL强度，我们发现nGO@TiO2纳米发光中的nGO和TiO2对彼此的ECL发射都有显著的增强作用，说明该纳米发光体中nGO和TiO2之间存在相互催化效应，并提出了可能的ECL机理。ECL-1是由82O82-电还原产生的SO4·-向TiO2价带中注入空穴，随后再与其导带中的电子复合产生的。在此反应过程中，nGO不仅具备优异的电子传递能力，而且作为纳米尺寸反应平台，nGO还可以促进OH·的产生，进而促进SO4·-的产生，增强ECL-1的信号强度。ECL-2是由被电还原的nGO和SO4·-反应产生的激发态产物在回到基态的过程中伴随的光发射，而TiO2能够通过促进电子的转移来增强ECL-2的强度。本工作首次合成了具有内部催化效应和电位分辨ECL性质的纳米发光体，对于设计新型高效的电位分辨ECL纳米发光体提供了新的思路。并且这种在中性水相条件下具有电位分辨ECL性质的纳米发光体可用于发展新型ECL分析探针或分析界面，对于疾病标记物的精准或多元分析具有重要的应用前景。
　　4、首次将无标记ECL生物分析和比率法结合起来，发展了无标记ECL比率型生物传感用于急性心肌梗死患者特异性标志物cTnI的检测，该传感器是利用具有双电位分辨ECL性质的nGO@TiO2纳米发光体构建了集双ECL信号输出、放大、识别多种功能为一体的纳米ECL传感平台。在cTnI存在下，与cTnI有高度亲和性的适配体在捕获cTnI后刚性增加，致使其远离电极表面，修饰工作电极上阻抗降低，提高该传感器的ECL信号强度。由于ECL-1信号强度增加的速率比ECL-2快，因而此双信号强度的比值随着cTnI浓度的增加而增大，根据信号增大的比值可以实现cTnI在1.0×10-13到1.0×10-10mol/L范围内的检测，其检测限为3.98×10-14mol/L，比文献中报道的其他基于无标记方法检测cTnI的传感器至少低一个数量级，并且该传感器可以满足健康人和急性心肌梗死患者血清中cTnⅠ的检测需求。本工作构建的ECL传感器具有以下优势:(1)由于它的双电位ECL信号来源于同一个纳米发光体，因此它比基于标记分析技术的ECL比率法更加简单、快速。(2)nGO@TiO2具有较好的生物兼容和环境友好性，且检测是在中性的水溶液中完成，因此，它可以较好的保持生物分子的活性。(3)此传感器在负电位范围内具有双电位ECL发射，电位窗口较窄，在1min中内即可快速完成检测。基于以上优势，本工作发展的无标记ECL比率型传感器在准确、灵敏、快速和特异性测定cTnⅠ方面具有重要的应用潜力，对于急性心肌梗死患者的早期诊断和治疗具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．2．1 化学发光的基本原理

1．2．2 化学发光的分析原理

1．2．3 液相化学发光体系

1．3 化学发光纳米发光体

1．3．1 化学发光纳米发光体概述

1．3．2 化学发光纳米发光体的类型及分析应用

1．4 无标记化学发光体外诊断分析方法

1．4．1 无标记化学发光体外诊断分析方法概论

1．4．2 无标记化学发光体外诊断分析方法类型

1．5 急性心肌梗死体外诊断方法

1．5．1 急性心肌梗死概述

1．5．2 急性心肌梗死标志物检测方法

1．6 本课题的提出

参考文献

第二章 吖啶酯功能化碳纳米发光体的合成及其化学发光特性研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与溶液

2．2．2 仪器

2．2．3 碳纳米颗粒和吖啶酯功能化碳纳米发光体的制备

2．2．4 化学发光检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 碳纳米颗粒和吖啶酯功能化碳纳米发光体的合成与表征

2．3．2 吖啶酯功能化碳纳米发光体组装机理

2．3．3 吖啶酯功能化碳纳米发光体的化学发光活性

2．3．4 吖啶酯功能化碳纳米发光体化学发光机理

2．3．5 吖啶酯功能化碳纳米发光体的荧光性质

2．3．6 基于AE-CNPs的过渡金属离子传感阵列

2．4 结论

参考文献

第三章 基于发光免疫金纳米组装体的无共反应试剂和无标记电化学发光免疫传感检测和肽素

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与溶液

3．2．2 仪器

3．2．4 和肽素抗体固载的cit-GNPs的制备及其圆二色谱

3．2．5 ECL传感器的组装过程

3．2．6 ECL检测和肽素

3．3 结果与讨论

3．3．2 Cu2+-Cys-ABEI-GNPs-CS的ECL特性

3．3．3 ECL传感器的组装策略

3．3．4 EcL传感器组装过程的表征

3．3．5 无共反应试剂和无标记ECL传感器的分析性能

3．3．6 ECL传感器的选择性

3．3．7 利用传感器检测健康人血清样品中的和肽素

3．4 结论

参考文献

第四章 内部催化和电位分辨的电化学发光纳米发光体：纳米氧化石墨烯包裹的二氧化钛

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与溶液

4．2．3 nGO、TiO2和nGO@TiO2纳米发光体的表征

4．2．4 ECL检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 nGO@TiO2纳米发光体的制备与表征

4．3．2 nGO@TiO2纳米发光体组装机理

4．3．3 nGO@TiO2纳米发光体的EcL性质

4．3．4 nGO@TiO2纳米发光体的EcL光谱

4．3．5 K2S2O8浓度影响

4．3．6 N2、O2和空气的影响

4．3．7 ECL机理

4．4 结论

参考文献

第五章 基于nGO@TiO2纳米发光体的无标记电位分辨电化学发光比率型适配体传感器检测心肌肌钙蛋白Ⅰ

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 试剂与溶液

5．2．2 仪器

5．2．5 ECL检测cTnI

5．3 结果与讨论

5．3．2 ECL传感器组装过程的表征

5．3．3 无标记ECL比率型传感器的分析性能

5．3．4 ECL传感器的选择性

5．3．5 实际样品检测

5．4 结论

参考文献

全文总结

攻读博士学位期间发表和待发表的论文

致谢