砷胁迫下细菌-噬菌体协作的发生及应用潜力研究

摘要

噬菌体是地球上最为丰富的生物实体，根据噬菌体能否将自身遗传物质插入宿主基因组进入溶原周期而区分为溶原性噬菌体(进入溶原周期的溶原性噬菌体称为原噬菌体)和裂性噬菌体。其中溶原性噬菌体能影响其宿主的遗传物质组成和表达，它可能可以提高宿主对于不良环境适应能力。然而，溶原性噬菌体在砷污染土壤中对于土壤微生物抵抗砷胁迫的作用还完全未知。在漫长的砷胁迫下，微生物进化出完整的抗砷系统以提升存活率，但是仍未知溶原性噬菌体是否参与了不同微生物间微生物抗砷系统的转导。　　本研究在实验中制备了一种多孔的可以供微生物附着的材料，经过在与采样点砷浓度相同的砷溶液中孵育后，用于在砷污染土壤中作为抗砷微生物的附着基质。为了避免微生物结构变化，从采样珠上洗脱的抗砷微生物马上使用丝裂霉素C(MC)诱导抗砷微生物基因组中的的原噬菌体。经过PCR扩增及测序验证，我们确定在石门磺厂的土壤抗砷微生物基因组中存在典型的抗砷基因arsC(砷脱毒还原基因)和arsM(砷甲基化基因)。为了了解噬菌体介导的水平基因转移是否参与砷抗性基因在环境微生物群落之间的交换，我们通过定量PCR检测了细菌基因组中片段砷抗性基因的丰度(归化为与细菌16SDNA的比例)和诱导产生的溶原性噬菌体基因组中砷抗性基因的的丰度(归化为与噬菌体数量的比例)。回归性分析表明溶原性噬菌体中arsC和arsM的丰度与土壤细菌基因组中arsC和arsM的丰度呈正相关。为了考察提取的环境中溶原性噬菌体在异位土壤中的异位转导能力并考察使用噬菌体处理砷污染的潜力，我们进行了微观宇宙实验，实验结果表明接种接近天然土壤中数量的含砷抗性基因的活噬菌体，引起了微观宇宙中arsC和arsM的总丰度以及增殖的噬菌体中arsC和arsM的相对丰度，这表明我们所提取的溶原性噬菌体具备异位感染能力。抗砷基因的增殖同样引发了微观宇宙中砷物种的变化，简言之三价砷含量显著上升。为了了解微观宇宙中砷生态毒性的真实变化，我们设计了土壤蚯蚓趋避实验，实验结果表明噬菌体接种后土壤砷毒性显著上升。　　本研究首次报道了抗砷微生物的基因组的原噬菌体中存在典型的微生物抗砷基因，并表明溶原性噬菌体参与了抗砷基因的水平基因转移。微观宇宙实验表明这些噬菌体具备异位感染能力，这引发了土壤中砷毒性上升。本文为了解噬菌体在全球砷循环中的角色奠定了基础。

目录

声明

第 1 章 绪论

1.1 选题背景

1.2 土壤砷污染

1.2.1 土壤砷污染现状

1.2.2 土壤中砷的来源

1.2.3 砷在土壤中的迁移转化及存在形态

1.2.4 土壤砷污染危害

1.3 土壤中砷污染治理方法

1.3.1 微生物修复技术及其进展

1.3.2 微生物修复作用机理

1.3.3 微生物对砷的迁移转化机制

1.3.4 其它处理方式

1.4 噬菌体及其在环境中的生态功能

1.4.1 噬菌体概述

1.4.2 噬菌体在土壤中的分布特征及其作用

1.4.3 噬菌体介导基因转移机制

1.4.4 土壤及其他环境中噬菌体携带功能基因情况

1.4.5 噬菌体在功能基因传播中的研究

1.5 研究意义及目的

第 2 章 砷污染土壤中抗砷菌的富集

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 仪器与设备

2.2.2 主要试剂耗材

2.2.3 培养液及培养基的配制

2.2.4 实验土壤概况

2.2.5 采样材料合成

2.2.6 采样装置制作

2.2.7 土壤样品采集与处理

2.2.8 提取采样器中微生物 DNA

2.2.9 实验数据处理分析

2.3 结果与分析

2.4 小结

第 3 章 溶原性噬菌体的诱导及抗砷基因的多样性分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 砷生物转化功能基因的引物选择

3.2.2 MC 诱导溶原性噬菌体

3.2.3 提取细菌 DNA 及 16S rRNA 基因测序。

3.2.4 噬菌体 DNA 提取

3.2.5 噬菌体透射电镜观察

3.2.6 噬菌体荧光显微电镜观察

3.2.7 实验数据处理分析

3.3 结果与分析

3.4 小结

第 4 章 探究溶原性噬菌体对砷功能基因的介导作用

4.1 前言

4.1.1 蚯蚓对砷的敏感性

4.1.2 蚯蚓对砷的生物可利用性

4.1.3 蚯蚓对砷的生物转化

4.1.4 砷对蚯蚓的毒性效应

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 土壤均质化和微观宇宙的建立

4.2.3 砷污染土壤中的噬菌体转导试验

4.2.4 土壤毒性试验

4.2.5 实验数据处理分析

4.3 结果与分析

4.4 小结

结论与展望

结论

展望

参考文献

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致 谢