木霉菌产孢突变体的筛选及其差异表达基因分析

摘要

哈茨木霉作为一类重要的植病生防真菌，对哈茨木霉的关键功能基因进行研究，能够提高对哈茨木霉生长、产孢以及生防等机理的了解，为研究优质生防制剂提供理论基础。目前已经有许多商品化的木霉菌制剂，其中以分生孢子制剂为主，但是木霉菌分生孢子的生产受环境的影响很大，如何稳定获取大量的孢子，仍是产业化生产的限制因素之一。因此，挖掘木霉菌分生孢子产生的关键基因，对增加木霉菌分生孢子产率、提高生防应用效果具有重要意义。本研究以本实验室自有的高效生防菌哈茨木霉T2-16为研究对象，建立木霉菌EMS诱变技术体系，并构建其突变体库，利用分生孢子、生长势等表型测定筛选不同产孢量的突变株，进一步开展转录组分析产孢差异表达基因，为挖掘木霉菌分生孢子产生的关键基因和丰富完善分生孢子产生的机制提供理论支撑。试验主要结果如下：　　1、以106cfu·mL-1哈茨木霉T2-16孢子浓度为诱变受体，经0.4mol·L-1EMS浓度处理4h，建立高效、稳定的哈茨木霉T2-16诱变技术体系并构建突变体库；经生长势、产孢能力及拮抗能力分析发现，一些突变子在菌落颜色、菌落扩展速度、产孢能力、拮抗能力等方面产生了明显的变化。稳定性遗传的418株突变菌株中在生长势呈正向突变占有率达46.20%，相对抑制率变化幅度超过30%的典型突变菌株占11.96%。　　2、通过PD培养基以及PDA培养基筛选产孢突变子发现，突变子T91、T120、T215、T240、T383在菌落颜色、分生孢子数目以及分生孢子梗等方面产生明显变化。并且经过系统地观察，确定以哈茨木霉T2-16以及突变子T215的产孢前期(30 h)和产孢高峰期(44 h)用于转录组测序。　　3、通过哈茨木霉T2-16和突变子T215转录组测序比较分析，结果表明：哈茨木霉T2-16与分生孢子产生有关的通路可能有氨基酸的生物合成、氨基糖和核苷酸的糖代谢、次级代谢产物生物合成、酪氨酸代谢等。其中主要富集在氨基酸的生物合成的半胱氨酸合成酶基因(GME2374_g)与半胱氨酸加双氧酶基因(GME7986_g)、主要富集在氨基糖和核苷酸的糖代谢代谢的内切几丁质酶基因(GME8986_g)与几丁质酶基因(GME10321_g)、主要富集在次级代谢产物生物合成苏氨酸醛缩酶基因(GME286_g)和甘油-3-磷酸脱氢酶基因(GME3499_g)以及主要富集在酪氨酸代谢的醛脱氢酶基因(GME426_g)和延胡索酰乙酰乙酸酶基因(GME3224_g)等可能为调控分生孢子产生的基因。

目录

声明

第1章 绪论

1.1.1 木霉概述

1.1.2 木霉生防机制

1.1.3 木霉菌制剂种类

1.1.4 木霉菌的产孢特性

1.1.5 木霉菌产孢的调控机制及相关基因

1.2 微生物诱变育种技术

1.2.1 微生物诱变育种技术概述

1.2.2 诱变育种方法

1.2.3 EMS诱变育种

1.2.4 突变株筛选

1.3 差异表达基因的研究方法

1.3.1 差异显示PCR(DD-RTPCR)

1.3.2 抑制性消减杂交

1.3.3 基因芯片

1.3.4 基于高通量测序技术的转录组测序技术

1.4 研究目的及意义

1.5 技术路线

第2章 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 供试培养基

2.1.3 主要仪器及设备

2.1.4 供试试剂

2.2 试验方法

2.2.1 哈茨木霉T2-16EMS诱变体系优化

2.2.2 突变菌株性状初步测定

2.2.3 孢子产生突变株产孢情况观察

2.2.4 哈茨木霉T2-16与产孢突变株转录组测序

第3章 结果与分析

3.1 哈茨木霉T2-16 EMS诱变条件的优化

3.2 哈茨木霉T2-16突变体库的构建

3.3 哈茨木霉T2-16突变菌株的生长势、拮抗能力比较

3.3.1 生长势比较

3.3.2 拮抗能力比较

3.4 哈茨木霉T2-16和部分产孢突变子产孢量差异

3.5 哈茨木霉T2-16产孢突变子筛选

3.5.1 利用PD培养基进行产孢突变子的筛选

3.5.2 利用PDA培养基进行产孢突变子的筛选

3.6 木霉菌产孢相关基因的建库和测序

3.6.1 取样时间的确定

3.6.2 RNA提取检测及测序文库构建

3.7 RNA-seq发掘木霉菌产孢相关基因

3.7.1 测序质量控制

3.7.2 基因注释和表达定量分析

3.7.3 差异表达基因（DEG）分析

3.7.4 同一菌株不同时期差异表达基因分析

3.7.5 同一时期不同菌株差异表达基因分析

3.8 木霉菌产孢相关基因的发掘

3.8.1 同一菌株不同时期差异表达基因分析

3.8.2 同种时期不同菌株差异表达基因分析

第4章 讨 论

结论

（1）本研究主要结论

（2）问题与展望

参考文献

附录 攻读学位期间所发表的学术论文

致谢