蜕皮激素滴度对家蚕幼虫蜕皮进程的调控机制研究

摘要

昆虫的表皮或外骨骼位于体壁最外层，对昆虫虫体起着保护和支撑的作用。然而，由于缺乏延展性，表皮又会限制昆虫的生长。因此，在发育过程中，昆虫需要多次的蜕去旧表皮与合成新的表皮，这个过程称为蜕皮。蜕皮是昆虫生长发育的基本生理现象，主要受蜕皮激素诱导。蜕皮激素是昆虫体内最为重要的两类激素之一。在昆虫蜕皮期，蜕皮激素并不是持续性存在，而是以“脉冲”方式（pulsatile manner）分泌，即在蜕皮前期，血液内激素浓度快速增加，然后又迅速恢复正常水平。这种浓度的改变会激活不同的蜕皮激素响应因子，调控不同靶基因的表达，从而控制昆虫的蜕皮进程。因此，蜕皮激素信号转导通路随着激素浓度波动所发生的改变对昆虫蜕皮进程的正常进行是十分关键的。　　目前，关于蜕皮激素上调对蜕皮过程中相关机制的研究已有大量的报道，而关于蜕皮激素下调对于昆虫的变态与发育的相关研究甚少。因此，本文主要通过在蜕皮激素滴度最高水平（D3）阶段注射外源的蜕皮激素，从而延长蜕皮激素作用时间，从表皮结构组成以及分子水平去探究蜕皮激素下调对于家蚕蜕皮的影响，最后针对表皮蛋白CPH家族成员CPH42进行表达调控与功能的验证，取得主要的研究结果如下：　　1、蜕皮激素浓度对幼虫蜕皮表型的影响　　在蜕皮过程中，基于HE染色和几丁质染色，本文首先检测表皮结构变化与蜕皮激素浓度的关联。发现食桑期A阶段表皮结构连接紧密，蜕皮激素滴度逐渐上升至C1阶段，表皮结构开始变得疏松，旧表皮逐渐降解，与上皮细胞开始分离，直到D3阶段时，蜕皮激素滴度已达到最高水平，紧接着开始下降，此时旧表皮已经大量降解，当蜕皮激素滴度下降至E2阶段时，大量的新表皮已经形成。在蜕皮激素浓度开始降低时（D3），注射不同浓度激素能显著抑制旧表皮的降解以及新表皮的形成过程，从而延长幼虫的蜕皮时间。　　2、蜕皮激素浓度对表皮相关基因表达的影响　　为进一步研究蜕皮激素脉冲对幼虫蜕皮的影响，本文通过转录组分析蜕皮激素滴度降低过程对表皮相关基因表达的影响，共组装得到转录本18414个。利用DESeq2对不同样本间差异表达基因进行鉴定，与E1时期相比，D3时期上调表达的基因有1383个，下调基因889个；E1与人为注射蜕皮激素后6小时相比，上调基因为499个，下调基因为689个。通过维恩图分析发现，478个蜕皮激素下调基因在正常的D3至E1发育过程中上调表达，237个蜕皮激素上调基因在正常的D3至E1发育过程中下调表达，由此说明，人为的提高蜕皮激素滴度将会延缓家蚕的发育进程；通过GO富集分析发现这些差异基因均富集到表皮结构组分中，并发现这类表皮结构相关基因基本都是表皮蛋白；通过热图分析，外源的蜕皮激素不仅抑制表皮蛋白的上调表达，而且也抑制了转录因子的表达，由此认为，蜕皮激素通过抑制转录因子的表达来调控表皮蛋白的表达。　　3、家蚕表皮蛋白基因BmCPH42的功能与调控机制研究　　本节选取具有代表性的表皮蛋白基因BmCPH42，通过qRT-PCR分析BmCPH42在各个时期的表达特征，结果发现该基因在E2时期高表达，同时分析了该基因在E2时期不同组织的表达量，发现在表皮和气管丛中高量表达；当人为的改变蜕皮激素滴度时，发现该基因的表达受到了抑制。基于转录组和ATAC-seq结果显示，转录因子βftz-F1以及HR38可能参与BmCPH42基因表达的调控。进一步，利用CRISPR/Cas9技术在家蚕胚胎中敲除βftz-F1以及HR38基因，能显著抑制BmCPH42基因的表达。另外，本文当BmCPH42基因的功能进行了研究，当该基因发生突变后，并没有出现个体水平表型的变化，由此说明表皮蛋白基因数量众多，该表皮蛋白基因功能冗余。　　综合以上实验结果，发现在蜕皮过程中，人为的提高蜕皮激素滴度会抑制新表皮的产生，以及旧表皮的降解，从而延长蜕皮时间；转录组分析这一现象的分子机制，发现外源的蜕皮激素通过抑制转录因子来调控响应的靶基因的表达；BmCPH42基因是在蜕皮过程中具有代表性的基因，该基因的表达调控受到蜕皮激素的影响。我们的结果为鳞翅目昆虫的蜕皮与变态相关研究提供新的研究思路，也证实了在家蚕蜕皮过程中蜕皮激素下调有助于新表皮的形成，以及旧表皮的降解。

目录

1 文献综述

1.1 概述

1.2 表皮结构

1.3 几丁质

1.3.1 几丁质的合成

1.3.2 几丁质的降解

1.3.3 几丁质结合蛋白的研究

1.4.1 表皮蛋白的分类及表达模式

1.4.2 昆虫的表皮蛋白在发育和表皮形成中的作用

1.4.3 表皮蛋白基因的调控关系

2 引 言

2.1 研究背景，目的及意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

3 蜕皮激素浓度对家蚕幼虫蜕皮表型的影响

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验设备

3.1.3 实验步骤

3.2.1 不同浓度的蜕皮激素对家蚕蜕皮的影响

3.2.2 家蚕4龄幼虫蜕皮期表皮组织结构的变化

3.2.3 蜕皮激素下调对于蜕皮的影响

3.3 讨论

4 蜕皮激素浓度对表皮相关基因表达的影响

4.1.1 实验材料

4.1.2 分析工具以及软件

4.1.3 RNA的提取

4.1.4 转录组数据分析

4.2.1 转录组的基本信息

4.2.2 外源蜕皮激素处理表皮蛋白差异基因的表达分析

4.2.3 表皮蛋白基因与转录因子表达相关性

4.3 讨论

5 家蚕表皮蛋白基因BmCPH42 的克隆与功能调控

5.1.1 实验材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 相关试剂的配制

5.1.4 主要仪器

5.1.5 引物

5.2 实验方法

5.2.1 家蚕表皮蛋白时空表达相关步骤

5.2.2 家蚕表皮蛋白BmCPH42的调控关系的相关步骤

5.2.3 家蚕表皮蛋白基因BmCPH42的功能验证相关步骤

5.3 实验结果

5.3.1 家蚕表皮蛋白基因BmCPH42在时空表达特征

5.3.2 家蚕表皮蛋白基因 BmCPH42表达的调控机制

5.3.4 靶基因敲除幼虫的表型分析

5.4 结论与讨论

6 结论与展望

参考文献

附录

学位论文数据集

致谢