基于炎症响应的载药中性粒细胞外泌体微环境靶向抗胶质瘤效应研究

摘要

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是最具侵袭性和致命性的原发性脑肿瘤，死亡率较高。传统肿瘤切除方案也由于胶质瘤的特殊位置受到一定限制，且术后往往因肿瘤的浸润性而导致预后不良。同时,血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）作为重要的生理屏障，在防止有毒物质入侵大脑的同时也阻止了大部分药物入脑。因此，设计能协助药物高效透过BBB的安全载体成为了胶质瘤研究的热点。基于此，越来越多的针对肿瘤炎症微环境的药物递送系统得以发展，如利用免疫细胞作为药物递送载体，但由于化疗药物往往对细胞有一定毒性，且免疫细胞在肿瘤微环境中扮演着多面的角色，这使得直接用免疫细胞作为药物载体存在一定的挑战性。　　外泌体（Exosomes,Exos）由于其纳米效应，免疫学特性，远距离靶向和天然透过生理屏障的特性作为药物递送载体已经受到广泛关注。研究表明，来源于细胞的Exos往往具有某些和祖细胞相同的成分或者相似的生物学功能。中性粒细胞（Neutrophils,NEs）由于能快速响应炎症并且具有天然穿透BBB的效应已被用于靶向肿瘤微环境的药物递送。本课题利用中性粒细胞来源的外泌体（NEs-Exos），通过对NEs-Exos的表征，探究了NEs-Exos透过BBB靶向肿瘤微环境以及响应趋化肽和炎症的能力。并以阿霉素（Doxorubicin,DOX）为抗肿瘤模型药物，通过胶质瘤原位移植模型在体评价NEs-Exos/DOX抗胶质瘤的效应。该研究有助于为胶质瘤和其他中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病的非侵入性炎性微环境靶向药物递送提供新的选择，也为基于Exos特性探索更多内源性载体工具提供新的机会。本课题的主要研究内容和相应的结果如下：　　①中性粒细胞的提取和表征：从小鼠骨髓中分离提取中性粒细胞，细胞纯度测定结果表明,提取的细胞中Ly-6G+CD11b+阳性细胞为89.24%。瑞氏染色结果显示细胞符合中性粒细胞的形态。　　②NEs-Exos和NEs-Exos/DOX的表征：NTA和TEM表征显示NEs-Exos表现为大小不均一的圆杯状或茶托状膜泡，峰值粒径为99.5±2.0nm，WB表明NEs-Exos中富含外泌体的标记蛋白（TSG101，Alix和CD63），NEs-Exos的Zeta电位为-11.80±1.31mV，证明我们成功提取了NEs-Exos。NEs-Exos装载抗癌药物DOX后，荧光图像显示NEs-Exos/PKH67（绿色）与DOX（红色）产生共定位（黄色），而NTA和TEM表明NEs-Exos/DOX的峰值粒径变大为134.0±10nm，形态表现出更多的异质性。这些结果表明NEs-Exos具有包裹药物的能力。并且NEs-Exos载药率为6.51%，包封率为13.71%。而NEs-Exos/DOX的Zeta电位变化不大，为-9.47±0.46mV。　　③NEs-Exos的细胞摄取：PKH67标记NEs-Exos，NEs-Exos/PKH67能被小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）和大鼠胶质瘤（C6）细胞摄取，随着时间的延长，NEs-Exos在细胞中的荧光强度逐渐增强。C6细胞显示出了较强的摄取能力。通过秋水仙碱，氯丙嗪，菲律平，布雷菲德菌素A和氯喹等多种抑制剂处理细胞后进行内化实验，发现氯喹影响的网格蛋白内吞途径在NEs-Exos/PKH67的细胞内化中占主导地位。　　④NEs-Exos响应于趋化因子透BBB体外评价：利用Transwell模型模拟体外BBB并探究NEs-Exos对趋化因子（fMLP）的响应。发现在fMLP条件下，12h的NEs-Exos/DOX在小室底部的积累量相比于不添加fMLP时增加了1.88倍，为36.24ng(以DOX计算)。同样的，在fMLP条件下，NEs-Exos/PKH67的荧光强度在C6细胞中逐渐增强，表明NEs-Exos具有与NEs类似的趋化能力，能有效地响应于趋化因子，并在体外穿透BBB。　　⑤NEs-Exos炎症响应评价：使用LPS建立体内体外炎症模型。LPS处理C6细胞和bEnd.3细胞后，细胞对NEs-Exos/PKH67的吸收相比于未处理组显著增加。而LPS损伤动物模型脑部切片表现为炎症细胞浸润，促炎因子（TNF-α）水平升高，抗炎因子（IL-10）表达降低，并且IBa1和GFAP表达均升高的炎性病理状态。LPS损伤后给药组脑部切片显示在IBa1和GFAP表达升高的同时伴随着更多的NEs-Exos/PKH26的累积，放大的荧光图像能更清楚的观察到该结果，说明炎症导致了NEs-Exos/PKH26的趋化运动。　　⑥NEs-Exos响应肿瘤微环境靶向透BBB在体评价：斑马鱼实验结果表明，较之游离DOX，NEs-Exos/DOX能渗出脑部血管将药物有效地递送到斑马鱼脑组织中。小动物成像实验结果表明，较之游离DiR，载有DiR的NEs-Exos/DiR能够透过BBB并在荷瘤小鼠脑部靶向聚集。体外成像进一步表明NEs-Exos/DiR主要在脑部胶质瘤区域累积。24h的脑部切片免疫荧光显示肿瘤内部为IBa1高表达和GFAP低表达的病理环境，并且NEs-Exos/DiR在代表肿瘤微环境的α-SMA高表达的区域累积。正常脑组织区域观察不到该现象，说明NEs-Exos/DiR能够响应胶质瘤炎性微环境，从而在胶质瘤区域靶向集聚。　　⑦体内药效学实验：NEs-Exos/DOX处理后，荷瘤小鼠脑部C6-Luc细胞的荧光强度相比于生理盐水组和DOX组增长缓慢，脑部肿瘤的生长得到了显著抑制。生存曲线也表明NEs-Exos/DOX组的存活时间显著高于对照组，其中位生存期为27天。脑部切片的H&E染色结果显示NEs-Exos/DOX组胶质瘤细胞排列稀疏，同时，免疫组化结果显示Ki-67在NEs-Exos/DOX组中相比于DOX组和生理盐水组表达较低，而GFAP相对表达较高，说明NEs-Exos/DOX能有效抑制肿瘤细胞的恶性增殖，降低胶质瘤恶性生物学行为。

目录

英汉缩略词对照表

1 绪 论

1.1 科学问题的提出

1.2 课题的主要内容和技术路线

1.2.1 NEs 的提取和分析

1.2.2 NEs-Exos 和 NEs-Exos/DOX的表征

1.2.3 NEs-Exos 的细胞摄取以及内化途径探讨

1.2.4 NEs-Exos 透过体外 BBB及响应趋化肽评价

1.2.5 NEs-Exos 透过体内 BBB及靶向肿瘤微环境评价

1.2.6 NEs-Exos 响应 LPS 损伤后的细胞模型和体内模型评价

1.2.7 NEs-Exos/DOX的体内药效学评价

1.2.8 课题的技术路线

1.3 课题的创新点

2 NEs-Exos的制备和表征

2.1 材料及仪器

2.1.1 材料

2.1.2 仪器

2.2 NEs的提取与分析

2.2.1 NEs 的提取

2.2.2 NEs 的纯度分析

2.2.3 NEs 的形态分析

2.3 NEs-Exos的载药率与包封率

2.3.1 NEs-Exos 的提取

2.3.2 NEs-Exos 载药

2.3.3 NEs-Exos 的载药率与包封率

2.4 NEs-Exos的表征

2.4.1 NEs-Exso 的 TEM表征

2.4.2 NEs-Exos 的 NTA表征

2.4.3 NEs-Exos 的 WB表征

2.4.4 NEs-Exos 的 Zeta电位

2.4.5 NEs-Exos 与 DOX共定位

2.5 结果和讨论

2.5.1 NEs 的提取与分析结果

2.5.2 NEs-Exso 的载药率与包封率

2.5.3 NEs-Exos 和 NEs-Exos/DOX的表征

2.6 小结

3 NEs-Exos的细胞吸收及内化途径探讨

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料

3.1.2 仪器

3.2 Exos的细胞摄取

3.2.1 bEnd.3 细胞的培养

3.2.2 C6 细胞的培养

3.2.3 Raw264.7 细胞的培养

3.2.4 细胞对 NEs-Exos 的吸收

3.3 NEs-Exos/PKH67的细胞内化途径探讨

3.4 结果与讨论

3.4.1 NEs-Exos 的细胞摄取

3.4.2 NEs-Exos 的内化途径探究结果

3.5 小结

4 NEs-Exos透过体外BBB及响应趋化肽评价

4.1 材料与仪器

4.1.1 材料

4.1.2 仪器

4.2 NEs-Exos响应趋化肽（fMLP）的评价

4.2.1 Transwell小室模型的建立

4.2.2 fMLP 对透过 BBB的 NEs-Exos/DOX的量的影响

4.2.3 fMLP 对下室 C6 细胞吸收 NEs-Exos/PKH67 的影响

4.2.4 fMLP 对 bEnd.3 细胞截留 NEs-Exos/PKH67 的影响

4.3 结果与讨论

4.3.1 Transwell小室模型图

4.3.2 NEs-Exos 响应趋化肽（fMLP）的评价结果

4.4 小结

5 NEs-Exos透过体内BBB及靶向肿瘤微环境评价

5.1 材料与仪器

5.1.1 材料

5.1.2 仪器

5.2 斑马鱼模型评价

5.3 小动物体内分布及脑部肿瘤微环境靶向评价

5.3.1 小动物体内分布实验

5.3.2 脑部肿瘤微环境中 NEs-Exos 的积累

5.4 结果与讨论

5.4.1 NEs-Exos 透斑马鱼血脑屏障实验结果

5.4.2 小动物体内分布实验结果

5.4.3 NEs-Exos 在脑部肿瘤微环境的积累结果

5.5 小结

6 NEs-Exos响应LPS损伤后细胞模型和体内模型评价

6.1 材料与仪器

6.1.1 材料

6.1.2 仪器

6.2 NEs-Exos响应 LPS 损伤后的细胞模型评价

6.3 LPS损伤后的脑部炎症模型建立和评价

6.3.1 LPS 损伤后的脑部炎症模型建立

6.3.2 LPS 损伤后的脑部炎症模型评价

6.3.3 NEs-Exos 响应 LPS 损伤后的体内模型评价

6.4 结果与讨论

6.4.1 NEs-Exos 响应 LPS 损伤后的细胞模型结果

6.4.2 NEs-Exos 响应 LPS 损伤后的体内模型结果

6.5 小结

7 NEs-Exos/DOX的体内药效学评价

7.1 材料与仪器

7.1.1 材料

7.1.2 仪器

7.2 C6-Luc原位胶质瘤模型的建立

7.3 荷瘤小鼠的药效学评价

7.3.1 荷瘤小鼠脑部荧光强度变化观察

7.3.2 荷瘤小鼠体重和生长曲线

7.3.3 荷瘤小鼠脑部及主要器官病理学观察

7.4 结果与讨论

7.4.1 肿瘤模型建模后常规观察

7.4.2 肿瘤药效学评价结果

7.5 小结

8 全文结论与后续工作建议

8.1 全文主要结论

8.2 后续工作建议

参考文献

附 录

A. 作者在攻读硕士学位期间所发表的文章目录：

B. 作者在攻读硕士学位期间参与的科研项目：

C. 学位论文数据集:

致 谢