WUSCHEL-related homeobox 4 (OsWOX4)调控水稻主根伸长的机理研究

摘要

水稻（Oryza sativa L.）既是重要的粮食作物，又是重要的单子叶模式植物。根系在水稻生长发育中扮演重要角色，与地上部株型、种子大小、产量等诸多农艺性状密切相关。目前，已经鉴定了多个参与水稻主根、不定根、侧根以及根毛发育的转录因子，但根系发育的调控网络仍需进一步阐明。　　在植物生长发育过程中，WUSCHEL（WUS）相关的同源异型盒（WUSCHEL-related homeobox，WOX）转录因子家族发挥重要调控作用，且特异性在植物中表达。作为WOX家族现代支中的一员，虽有研究表明OsWOX4调控茎顶端分生组织以及叶的生长发育，但其在根系发育中的功能尚未报道。本文通过遗传转化，获得OsWOX4的RNA干扰株系（OsWOX4-RNAi）以及过表达株系（OsWOX4-OE），以上述转基因株系为研究材料，研究了OsWOX4在水稻主根发育中的生物学功能以及调控机制。主要研究结果如下：　　①分析了OsWOX4在水稻各组织器官中的时空表达模式及对激素和非生物胁迫的响应，并研究了其蛋白的亚细胞定位。荧光定量PCR（qPCR）分析表明，OsWOX4在水稻各个发育阶段均有表达，且在年幼的茎、根、种子中表达量较高；OsWOX4也受外源生长素IAA、2,4-D、NAA以及细胞分裂素的诱导上调表达，同时受非生物胁迫信号如NaCl、甲基紫精（methyl viologen，MV）、干旱等诱导上调表达。亚细胞定位试验结果表明：OsWOX4定位在细胞核，表明它是一个核转录因子。　　②获得OsWOX4的干扰株系OsWOX4-RNAi以及过表达株系OsWOX4-OE，研究OsWOX4在水稻主根伸长中的功能。与野生型（DJ）相比，OsWOX4-RNAi主根长度显著增加，而OsWOX4-OE的主根长度显著减小；通过微流控系统结合显微镜观察，发现OsWOX4-RNAi主根的生长速率显著高于野生型植株。　　③OsWOX4通过调控主根根尖分生区长度以及成熟区细胞长度来调控主根伸长。与野生型相比，OsWOX4-RNAi植株主根分生区长度显著增加，其成熟区表皮细胞长度也显著增加，调控细胞分裂的基因OsCYCB1;1和静止中心特异表达基因QHB的转录水平升高；而OsWOX4-OE植株则相反。　　④OsWOX4调控主根中生长素的合成和运输。与野生型相比，内源生长素含量在OsWOX4-OE植株中显著减少；OsWOX4-OE的主根生长发育缺陷可由外源NAA、IAA、2,4-D弥补；根的向重力性试验表明，OsWOX4-RNAi植株主根的向重力性强于野生型，暗示OsWOX4转基因植株根系中生长素极性运输发生改变；同时OsWOX4影响了生长素合成和运输基因的表达。　　⑤OsWOX4通过结合生长素输入载体OsAUX1的启动子序列直接调控该基因的表达。瞬时转录激活试验表明，当携带OsAUX1Pro::GUS与OsWOX4-62SK的农杆菌侵染液共同注射烟草叶片时，OsWOX4能激活OsAUX1的瞬时表达（烟草叶片变蓝）；凝胶迁移阻滞试验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）表明，重组OsWOX4-His蛋白能结合OsAUX1启动子序列TAAT保守基序。　　⑥OsMADS25作用在OsWOX4的上游直接调控该基因的转录。双萤光素酶活性分析试验表明，当携带OsWOX4Pro::LUC与OsMADS25-62SK的农杆菌侵染液共同注射烟草叶片时，OsWOX4Pro启动的LUC活性受到显著抑制，表明OsMADS25抑制OsWOX4的转录；EMSA证明OsMADS25能结合OsWOX4启动子的保守基序CArG-box。　　⑦OsWOX4的表达水平影响水稻农艺性状。在苗期或成熟期，与野生型相比，OsWOX4-RNAi以及OsWOX4-OE的株高均显著降低；此外OsWOX4-OE种子的长度及宽度均大于野生型。　　以上结果表明：OsWOX4通过调控生长素输入载体OsAUX1的表达，从而影响IAA含量及水稻主根的伸长。

目录

缩略词

1 绪 论

1.1.1 WOX转录因子的分类和结构

1.1.2 WOX家族转录因子功能以及作用机制

1.1.3 OsWOX4 的研究进展

1.2.1 生长素的合成

1.2.2 生长素的信号转导

1.2.3 生长素的运输

1.3 水稻根系的研究进展

1.4 课题的选题及意义

1.5 课题的研究内容

1.6 课题的技术路线

1.7 课题的创新点

2 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验设备

2.1.3实验试剂以及培养基

2.2.1 水稻培养以及生长素处理

2.2.2 激素以及胁迫处理

2.2.3 大肠杆菌转化以及农杆菌转化

2.2.4 OsWOX4 干扰载体以及过表达载体构建

2.2.5 水稻基因组提取以及阳性鉴定

2.2.6 时空表达材料收集以及蛋白亚细胞定位

2.2.7 主根生长速率测定

2.2.8 醋酸洋红染色、碘化丙啶染色以及淀粉碘化钾染色

2.2.9 生长素含量测定（HPLC法）以及向重力性

2.2.10 RNA提取及荧光定量qPCR

2.2.11 OsWOX4 蛋白表达纯化以及凝胶迁移阻滞试验

2.2.12 GUS以及LUC实验

2.2.13 数据分析

3 结果与分析

3.1.1 OsWOX4 时空表达模式

3.1.2 OsWOX4 在不同激素以及非生物胁迫下的响应

3.1.3 OsWOX4 亚细胞定位

3.2.1 转基因水稻株系筛选

3.2.2 OsWOX4 在水稻主根发育中的功能分析

3.2.3 OsWOX4 表达水平的变化对主根伸长速率的影响

3.3.1 OsWOX4 对根尖分生区大小的影响

3.3.2 OsWOX4 对根尖成熟区表皮细胞大小的影响

3.4 OsWOX4 转基因植株对外源生长素响应

3.4.1 OsWOX4 转基因植株在外源生长素作用下的表型

3.4.2 OsWOX4 转基因植株主根向重力性

3.4.3 OsWOX4 对生长素代谢路径相关基因的影响

3.5.1 OsWOX4 结合OsAUX1 启动子调控其表达

3.5.2 OsWOX4 瞬时激活OsAUX1的转录

3.6.1 OsMADS25转录谱中WOX转录因子表达量

3.6.2 OsMADS25对OsWOX4 的直接调控

3.6.3 OsMADS25抑制OsWOX4的转录

3.7 OsWOX4 转基因植株农学性状

4 讨 论

4.1 OsWOX4 可能够通过调控生长素运输来调节主根的发育

4.2 WOX家族中OsWOX4 功能可能是与众不同的

5 总结和展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录

A. 论文中涉及的引物序列

B. 硕士期间论文发表情况

C. 学位论文数据集

致谢