基于多种相互作用的固相萃取和纳米载药研究

摘要

非键相互作用是自然界中普遍存在的分子间相互作用。物质与物质之间可以通过相互作用而产生联系。在分析科学各领域，更是利用各种各样的相互作用来研究和分析所关注的对象。分析科学（包括分析化学和药物分析）始终以3S（Sensitivity，Selectivity，Speediness）和3A（Accuracy，Automatics，Application）为研究目标，具有很高的科学研究指导意义。　　固相萃取技术（SPE）作为样品前处理中重要的一环，其萃取的过程涉及萃取材料与分析对象之间的相互作用关系。因此，有效的萃取方法、新萃取材料以及先进的固相萃取装置始终是该领域研究发展方向。　　本论文对萃取方法进行了开发，利用具有不同识别机理的分子印迹聚合物（MIPs）作为萃取材料。通过两步萃取法，从复杂体系中获得了唯一的目标化合物，大大提高了萃取选择性。同时，吸附实验、斯卡查德方程以及萃取条件研究表明MIPs对目标化合物的识别主要基于MIPs上的功能单体与分子上官能团的结合强度以及分子进入MIPs空穴时的空间取向与匹配程度，这为MIPs识别分子的机理具有一定指导作用。　　本论文提出以生物分子与化合物之间所存在的相互作用为研究基础，初次尝试将活细菌作为生物萃取材料，用于低浓度下氧氟沙星的萃取。同时，将活细菌固定在毛细管内壁，发展了一种管内细菌-固相萃取装置。该装置能够较好的实现样品萃取、淋洗以及洗脱步骤。通过荧光显微观察，管内活细菌对氧氟沙星具有一定萃取能力。　　本论文还提出了一种以简便性和分析灵敏度为追求目标的注射式固相萃取-液相色谱联用技术（Syringe SPME-LC），并用于水中的邻苯二甲酸酯的萃取和分析。该技术实现了萃取、脱附、进样分离分析全过程。该装置也无需对液相色谱仪器的进样接口进行改造。同时，对水中邻苯二甲酸酯的萃取结果显示出很好的效果。　　回归SPE的本质是分析物与萃取相（固相）和被萃取物（液相）之间的相互作用关系，这类似于纳米载药体系中药物与载体（固相）和机体内环境（包括传递和释放下的环境，通常为液相）之间的关系。这三层关系也就是一个纳米载药体系的全过程整体性研究。因此，本论文利用去溶剂法成功制备了糖基化白蛋白姜黄素纳米药物（Gal-BSA-Cur NPs）。药物体外释放实验表明Gal-BSA-Cur NPs与普通姜黄素相比具有更好的体外释放率且更长的释放时间。在传递环节，采用人结肠癌Caco-2细胞和尤斯（Ussing）肠吸收模型对该纳米药物进行了肠吸收评价。结果表明肠道对Gal-BSA-Cur NPs具有更好的吸收效果，且具有双重肠吸收机制，即网格蛋白介导的内吞作用和被动转运。大鼠药代动力学研究表明，Gal-BSA-Cur NPs的血药浓度高于普通姜黄素。其他药代参数表明，该纳米药物有助于姜黄素生物利用度的提高。这些说明了该纳米药物可以通过促进肠吸收而提高药物生物利用度。在释药环节，对Gal-BSA-Cur NPs进行了抗肝癌活性的研究。该纳米药物对肝癌细胞具有一定的毒性作用且能够抑制细胞增殖以及迁移。同时，通过细胞凋亡和细胞荧光免疫分析，Gal-BSA-Cur NPs可能通过抑制核转录因子κB-p65蛋白（NF-κB-p65）的表达来诱导肝癌细胞凋亡。　　综上，固相萃取与纳米载药体系传递在物质相互作用上有一定的相似性。载药过程类似萃取相作用于萃取化合物，而释药过程类似化合物从萃取相中解离。虽然是类似，但纳米载药体系相比固相萃取具有更加复杂的涉及生命体中的相互作用类型。这种以基本相互作用性质的研究为更多研究领域，特别是交叉性领域提供了一定的研究思路。

目录

1 绪 论

1.1 固相萃取与相互作用

1.1.1 固相萃取发展历史

1.1.2 固相萃取机理

1.1.3 固相萃取步骤

1.1.4 固相萃取材料

1.1.5 新型的固相萃取材料和方法

1.2 分子印迹技术（MIT）

1.2.1 分子印迹发展历史

1.2.2 分子印迹原理

1.2.3 分子印迹聚合物的制备

1.2.4 分子印迹聚合物与模板分子之间的相互作用

1.2.5 分子印迹固相萃取的应用

1.2.6 提高分子印迹固相萃取选择性的方法

1.3 固相微萃取（SPME）

1.3.1 固相微萃取发展历史

1.3.2 固相微萃取基本理论

1.3.3 固相微萃取基本类型

1.3.4 SPME-LC自动化联用系统

1.3.5 固相微萃取新方法

1.4 纳米载药体系（NDDS）中的相互作用

1.4.1 NDDS发展历史

1.4.2 载药中的相互作用

1.4.3 纳米药物传递与机体的相互作用

1.4.4 纳米药物释放与体内药物效应的关系

1.4.5 纳米载药体系整体性研究思路

1.5 研究命题及其意义

1.6 研究内容与技术路线

1.7 本论文创新之处

1）本论文从理论上推测了分子印迹聚合物识别分子的差异性，以每种分子所具有的不同的吉布斯自由能以及进入MIPs空穴时空间取向不同为出发点

2）研制了一种新型的注射式固相微萃取装置

3）研制了一种管内细菌-固相微萃取装置。

4）对一个纳米载药体系进行了全过程整体性研究

2 双分子印迹顺序固相萃取新方法研究

2.1 引言

2.2.1 实验材料和仪器

2.2.2 分子印迹聚合物（MIPs）制备与特性评价

2.2.3 MIPs和 NIPs的吸附机理分析

2.2.4 创建双分子印迹聚合物两步固相萃取法

2.3 结果与讨论

2.3.1 MIPs和 NIPs的研制与其特征

2.3.2 MIPs的吸附特征与吸附机理

2.3.3 选择性的双分子印迹聚合物两步固相萃取法（TMIPs-TSPE）

2.4 本章小结

3 直接注射式固相微萃取与液相色谱联用初探

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 实验准备与 HPLC 条件

3.2.3 直接注射式固相微萃取器的研制

3.2.4 新固相微萃取装置-液相色谱联用的搭建与操作

3.2.5 SPME的条件优化

3.3 结果与讨论

3.3.1 萃取时间对固相微萃取效率的影响

3.3.3 解吸时间对固相微萃取效率的影响

3.3.4 解吸体积对固相微萃取效率的影响

3.3.5 萃取浓度对固相微萃取的影响

3.4 本章小结

4 管内活细菌-固相萃取技术的初探

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 管内细菌的培养与活性评价

4.2.3 细菌作用药物后的状态

4.2.4 管内细菌-固相微萃取法的建立与操作

4.3 结果部分4.3.1 管内活细菌涂敷情况分析

4.3.2 细菌活性评价

4.3.3 实时操作过程的监测

4.4 本章小结

5 糖基化白蛋白纳米载药体系的研制

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂和仪器

5.2.2 糖基化牛血清白蛋白（Gal-BSA）的制备与表征

5.2.3 糖基化白蛋白姜黄素纳米粒（Gal-BSA-Cur NPs）的制备与表征

5.2.4纳米药物的包封率和载药量测定

5.2.5 纳米药物释放行为

5.2.6 数据处理

5.3 结果与讨论

5.3.1 Gal-BSA-Cur NPs制备流程

5.3.2 Gal-BSA特性评价

5.3.3 Gal-BSA-Cur NPs特性评价

5.3.4 纳米药物的包封率和载药量

5.3.5 纳米药物体外释放行为

5.4 本章小结

6 糖基化白蛋白纳米载药体系靶向治疗肝癌研究

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 试剂和仪器

6.2.2 细胞培养

6.2.3 细胞对纳米药物的摄取能力评价

6.2.4 评价纳米药物对细胞毒性与增殖

6.2.5 评价纳米药物对细胞迁移行为

6.2.6 纳米药物对细胞凋亡及其信号通路的研究

6.2.7 数据处理

6.3 结果与讨论

6.3.1 Gal-BSA-Cur NPs对癌细胞作用过程

6.3.2 细胞对纳米药物的摄取及竞争性结合分析

6.3.3 纳米药物对细胞毒性与增殖的影响

6.3.4 纳米药物对细胞凋亡的情况分析

6.3.5 纳米药物对细胞迁移行为的影响

6.3.6 纳米药物抑制癌细胞的机制研究

6.4 本章小结

7 糖基化白蛋白纳米载药体系的肠吸收与生物利用度考察 7.1 引言

7.2 实验部分

7.2.1 实验材料和仪器

7.2.2 细胞培养与动物准备

7.2.3 评价药物对细胞毒性

7.2.4 评价细胞对药物的摄取能力与机制

7.2.5药物的肠吸收转运研究

7.2.6 口服纳米药物的方法学评价与药代动力学研究

7.2.7统计分析

7.3.1 纳米药物剂量的选择

7.3.2 细胞对纳米药物的摄取情况研究

7.3.3 细胞摄取纳米药物的机制研究

7.3.4 细胞渗透与转运机制的研究

7.3.5 方法学验证

7.3.6 Gal-BSA-Cur NPs的药代动力学研究

7.4 本章小结

8 结论与展望

8.1 研究结论

8.2 展望

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表及拟发表文章目录：

B. 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录：

C. 学位论文数据集

致谢