拟南芥TWD1调节油菜素甾醇信号转导通路的早期过程

摘要

油菜素甾醇（brassinosteroids，BRs）是一类植物特有的内源性甾醇激素，它在植物营养生长和生殖生长的各个方面都发挥着重要的生理作用。BRs由细胞膜上受体BRI1和共受体BAK1组成的复合体感受并起始信号转导，经细胞质内一系列的磷酸化/去磷酸化活动级联放大信号至细胞核内转录因子BES1/BZR1以调控基因表达。共受体 BAK1及其所属的SERK家族的其它四个成员均是富亮氨酸重复类受体激酶（LRR-RLKs）。目前的研究表明 BAK1与其它 SERKs成员参与BR信号转导、光依赖的细胞死亡、花药发育、植物固有免疫以及气孔分化等多个生理活动。而对BAK1的两个突变体elg和bak1-5的研究，进一步指出BAK1功能具有复杂的多样性，即便是在研究最深入的BR信号转导中它也可能存在未知的功能。此外，鉴于BR信号转导的早期过程即细胞膜附近的信号传递活动仍有诸多细节不甚清楚，故我们拟以BAK1为出发点继续深入研究。　　本研究首先以 bak1-4为遗传背景建立 T-DNA插入库，并筛选可能的与BAK1一起共同介导BR信号或其它信号途径的功能组分。其间获得一个典型的BR不敏感突变体128-12-T01，T-DNA侧翼序列克隆后发现它是TWD1的一个新突变体故重命名为twd1-4。同时另一个点突变体twd1-5从EMS诱变库中筛选到并被用于后续研究中。twd1-5对外源施加的油菜素内酯（brassinolide，BL）不敏感而对特异的合成抑制剂超敏感，说明它也是BR不敏感型突变体。杂交实验显示TWD1不直接参与BRs合成，而是位于BR合成通路的下游。尽管TWD1定位于内质网并参与ABCB1和ABCB19的转运，但我们发现超表达TWD1不能恢复bri1的表型。而且twd1-5中BRI1的细胞膜定位及其蛋白稳定性均未改变，即是说 TWD1并未涉及 BRI1的内质网质量控制活动。而同时作为膜蛋白的TWD1，经生化实验证实它在细胞膜上与受体BRI1相互作用。twd1-5中BR信号转导受阻，是由于该缺失导致BL诱导的BRI1和BAK1磷酸化显著减少。此外，TWD1的缺失同时也导致BL诱导的BRI1、BAK1间相互作用减弱故而影响整个 BR信号的起始。遗传及生化证据指明 TWD1通过与 BRI1相互作用参与BR信号转导的早期过程，起到维持上游信号传递的作用。　　随后为进一步寻找BR信号通路相关基因，我们从已有的研究中分析筛选出44个BR相关基因并将其超表达到合成突变体br6ox2中观察其表型改变。其中BED1基因超表达后使br6ox2叶片变小、植株变矮、果荚缩短，随后在Col-0中也重现到类似表型。BED1超表达材料（BED1-OX）的幼苗对BR处理有轻微的不敏感，其成体植株呈现明显的BR缺失突变体表型。BED1-OX同时也具有典型的erecta突变体表型，包括成簇的花序、果荚变短变宽及果柄缩短等；但未发现与erecta类似的气孔发育缺陷。人工微RNA（amiRNA）技术构建的BED1缺失突变体并无明显表型而超表达 BED1的同源基因BEDL2、BEDL3呈现与BED1-OX类似的表型，说明它们的功能冗余。深入分析发现，持续激活MAPK途径的组分YODA、MKK4和MKK5可以将BED1-OX植株恢复至野生型表型。这些结果说明BED1采用和ERECTA类似的MAPK途径，可能通过抑制细胞增殖和促进分化来调控植物花序发育，而这一过程很可能需要受体 ERECTA和其共受体BAK1（SERKs）的参与。　　此外使用全长cDNA超表达捕获技术（FOX hunting system）在bri1-9背景下筛选恢复型突变体时我们获得一株茎端分生组织增生的突变体cil9-s1。基因克隆及重现实验确定其为过量表达RNA聚合酶非催化亚基NRP(B/D/E)6A所致。超表达NRP(B/D/E)6A及同源基因NRP(B/E)6B不影响RNA聚合酶IV和V的功能，但却产生多种不稳定且类似RNA聚合酶II的相关缺失突变体nrpb2-1的表型；但这些表型与 BR合成及信号转导可能并无直接联系。NRP(B/D/E)6A和NRP(B/E)6B各自单突变体没有明显表型，但其双突体则出现胚胎发育滞后、胚柄异常膨大等多种缺陷以致最终胚胎死亡。这些结果指出NRP(B/D/E)6A在植物的分生组织和胚胎发育过程中起着至关重要的作用。

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第一章 文献综述

1.1 油菜素甾醇合成通路

1.2 油菜素甾醇信号通路

1.3 BAK1的多功能性

1.4本研究目的、内容和意义

第二章 TWD1参与BR信号转导的早期事件

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 TWD1功能讨论

2.5 BAK1质谱（Semi-in vivo pull-down plus LC/MS/MS）数据分析

2.6 br6ox2和cpd91背景下激活标签筛选

第三章 BED1依赖MAPK途径调控植物花序发育

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 BED1功能讨论

第四章 NRP(B/D/E)6A调控植物分生组织及胚胎发育

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 NRP(B/D/E)6A功能讨论

参考文献

在学期间的研究成果

致谢