巢湖水华蓝藻藻蓝蛋白提取纯化研究

摘要

由蓝藻细胞中提取的藻蓝蛋白运用十分广泛，不仅具有抗炎、抗癌、治疗脑缺血损伤等医疗活性，还具有免疫荧光特性可用于制作荧光探针。本论文以巢湖水华新鲜蓝藻为研究对象，通过冻融破壁方法提取藻蓝蛋白粗提液，以藻蓝蛋白的纯度和得率为指标，在此基础上，通过多步盐析结合双水相萃取方法纯化藻蓝蛋白。并且，本文对纯化后的藻蓝蛋白稳定性进行了一定程度的研究。主要内容摘要如下:
　　1.冻融破壁实验研究。分别研究了蓝藻不同冻融次数、不同含水率和不同冻融介质对提取藻蓝蛋白效果的影响。结果表明:当蓝藻含水率为96.0％～97.5％，冻融介质为0.0025mol/L的PBS缓冲液时，反复冻融2-3次即可得到最佳的冻融破壁效果。
　　2.硫酸铵多步盐析实验研究。在冻融破壁效果最佳时，获得一定量藻蓝蛋白粗提液。在四步盐析中，分别运用0.618法优选不同饱和度的硫酸铵投加量，精确研究各步盐析中最适硫酸铵投加量;并且运用正交实验法研究了一步盐析和两步盐析不同的实验条件对纯化藻蓝蛋白效果的影响。结果表明:冻融后离心去渣并分别用21％、30.4％、26.28％和47.76％饱和度的硫酸铵进行四步盐析可得到纯度为3.157的藻蓝蛋白，然后将藻蓝蛋白置于10万道尔顿的透析袋中透析12h，得纯度为3.60的藻蓝蛋白。
　　3.双水相萃取实验研究。以藻蓝蛋白纯度和得率为指标，经过冻融和盐析所得的藻蓝蛋白液，再研究两次双水相萃取的不同条件对藻蓝蛋白提取效果的影响。结果表明:考虑到实验时间和操作步骤的简化，在一次萃取中选用分子量为1000的聚乙二醇，其质量浓度为10％，硫酸铵质量浓度为15％，静置时间为2h;在二次萃取中选择聚乙二醇的质量浓度为10％、硫酸铵的质量浓度为20％，静置时间为2h。
　　4.藻蓝蛋白稳定性实验研究。考察了光照、时间、环境温度、pH、乙醇及常见食品添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响。结果表明，藻蓝蛋白在避光、30℃以下、pH为中性条件下保持稳定，超出此范围其稳定性下降，添加乙醇和柠檬酸会导致藻蓝蛋白稳定性下降，而氯化钠和苯甲酸钠对藻蓝蛋白稳定性影响较小。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 巢湖及其地理位置

1．1．2 巢潮流域概况

1．1．3 历史上的巢湖

1．1．4 巢湖水体现状

1．2 研究意义

1．2．1 巢湖富营养化危害

1．2．2 巢湖蓝藻常见的处理办法

1．2．3 水华蓝藻资源化利用现状

1．3 研究概述

1．3．1 基本概念

1．3．2 藻蓝蛋白提取纯化国内外研究现状

1．3．3 藻蓝蛋白提取纯化

1．3．4 现存的主要问题和不足

1．4 课题的提出

1．4．1 选题依据

1．4．2 研究内容

第二章 冻融实验条件探究

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料与仪器

2．2．2 实验步骤

2．3 分析方法

2．4 实验结果与讨论

2．5 本章小结

第三章 盐析法提取纯化藻蓝蛋白

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 主要实验试剂及器材

3．2．2 实验步骤

3．3 分析方法

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 四步盐析法提取藻蓝蛋白实验结果

3．4．2 盐析正交实验结果

3．4．3 膜过滤实验条件对提取藻蓝蛋白的影响

3．5 本章小结

第四章 双水相萃取制备藻蓝蛋白

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料与器材

4．2．2 实验步骤

4．3 分析方法

4．4．1 藻蓝蛋白纯度的计算

4．3．2 藻蓝蛋白回收率计算

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 双水相一次萃取正交实验

4．2．2 双水相二次萃取单因素实验结果

4．4．3 静置时间对双水相萃取效果的影响

4．5 本章小结

第五章 藻蓝蛋白稳定性研究

5．1 前言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料与器材

5．2．2 实验步骤

5．3 分析方法

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 藻蓝蛋白的光照和时间稳定性

5．4．2 藻蓝蛋白的温度稳定性

5．4．3 藻蓝蛋白的酸碱稳定性

5．4．4 藻蓝蛋白对常见食品添加剂的稳定性

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．1．1 冻融破壁蓝藻细胞的研究

6．1．2 盐析法提纯藻蓝蛋白的研究

6．1．3 双水相萃取藻蓝蛋白的研究

6．1．4 藻蓝蛋白稳定性实验的研究

6．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文