SO2延缓小麦糊粉层细胞程序性死亡及缓解铝胁迫的信号机制研究

摘要

禾谷类种子萌发后期，在糊粉层细胞完成水解酶的合成与分泌之后，糊粉层细胞会自主有序地发生死亡，这种类型的细胞死亡属于细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)。禾谷类种子的糊粉层细胞已成为研究植物细胞程序性死亡的模式细胞。本论文以小麦糊粉层为研究材料，考察了SO2供体(NaHSO3∶Na2SO3)对糊粉层细胞程序性死亡进程的影响及相关的调节机理。结果表明，经SO2供体处理小麦糊粉层细胞，可明显延缓其细胞程序性死亡的进程，且呈一定的浓度效应。与对照相比，经过不同浓度SO2供体(10、50、100μM)处理糊粉层细胞均可延缓其细胞死亡，其中100μM SO2供体延缓细胞死亡的效果最为显著。100μM SO2供体能延缓糊粉层细胞可溶性蛋白的降解，延缓细胞内蛋白质贮藏液泡(protein storage vacuoles，PSV)的扩大。此外，SO2还能延缓糊粉层细胞DNA降解。研究发现，SO2能显著提高糊粉层细胞硫代谢相关基因TaSultri4;1a、TaSiR、TaOASTL、TaCoA、TaGHPOD表达水平，抑制TaSultri;1，TaAPR基因表达。
　　活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的迸发是糊粉层细胞程序性死亡的一个显著事件，大量的ROS会加快糊粉层细胞的程序性死亡进程。本文对SO2是否作为一种抗氧化信号分子参与调控ROS的水平，进而介导了糊粉层细胞程序性死亡，进行了相关研究。结果表明，SO2可以明显减少程序性死亡进程中的小麦糊粉层细胞内过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子（·O2-）等活性氧含量，提高糊粉层细胞内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等相关酶活性，上调CAT、APX及SOD酶的基因表达，表明SO2具有抗氧化信号，参与调控小麦糊粉层细胞程序性死亡进程，行使其延长糊粉层细胞存活时间等生理功能。
　　硫化氢(Hydrogen Sulfide，H2S)是植物体内继CO、NO的第三种气体信号分子，而SO2供体(NaHSO3∶Na2SO3)在植物细胞中亚硫酸还原酶的作用下生成H2S，本文对SO2是否通过H2S信号通路，调控小麦糊粉层细胞程序性死亡进程，进行了相关研究。H2S处理小麦糊粉层细胞实验结果表明，糊粉层细胞死亡率显著降低，内源H2S及NO的含量明显提高。而在NO清除剂(Carboxy-cPTIO，cPTIO)的条件下，H2S处理的小麦糊粉层细胞死亡率明显上升，其内源H2S含量明显下降，其抗氧化相关基因TaCAT、TaAPX、TaSOD的表达水平均有所下降。SO2处理糊粉层后，内源H2S及NO含量也显著提高，且NO清除剂和SO2处理小麦糊粉层，其内源H2S含量减少，抗氧化基因TaCAT、TaAPX、TaSOD表达水平明显下降。这表明SO2通过H2S信号通路，产生内源NO以及H2S，然后通过内源信号分子调控抗氧化酶相关基因表达，最后延缓小麦糊粉层细胞程序性死亡。
　　本文还对H2S调控小麦种子淀粉酶活性的影响进行了研究。结果表明，H2S可以提高β-淀粉酶的活性，并呈一定的剂量效应，与对照相比，不同浓度的H2S供体（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mM）均可以提高β-淀粉酶的活性，其中1.5 mM的H2S供体提高小麦种子β-淀粉酶活性最为明显。进一步研究表明，H2S可以明显提高自由态β-淀粉酶的活性以及结合态β-淀粉酶的活性。与H2S作用类似，0.8 mM SO2也可以明显提高小麦种子结合态β-淀粉酶的活性。
　　本文对SO2是否缓解铝胁迫小麦胚根的毒害作用进行了相关研究。结果表明，0.4 mMA1对小麦胚根生长具有明显抑制作用;而且1.0 mM SO2对小麦胚根生长没有明显的毒害作用，SO2可缓解铝胁迫小麦胚根生长的毒害作用。进一步研究表明，SO2可以减少铝胁迫小麦胚根的ROS的积累，缓解铝胁迫小麦胚根膜损伤，减少胚根的铝累积。另外，本论文还对SO2调控铝胁迫小麦胚根的铝诱导基因的表达进行了研究，结果表明，SO2可以明显减少铝诱导基因TaWali1，TaWali2、TaWali3、TaWali5、TaWali6、TaALMT1的基因表达量。综上所述，SO2减少活性氧的积累、提高硫代谢基因的表达、提高淀粉酶的活性，可达到延缓糊粉层细胞的死亡，缓解铝胁迫胚根的生长，从而提高小麦种子萌发及生长。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 前言

1．1 植物细胞及糊粉层程序性死亡的研究进展

1．1．1 细胞程序性死亡的研究概述

1．1．2 糊粉层细胞PCD研究进展

1．2 H2S信号分子在植物中的研究进展

1．2．1 H2S的理化性质及生理特性

1．2．2 H2S延缓植物衰老及PCD作用机制的研究进展

1．3 SO2信号分子在动、植物中的研究进展

1．3．1 SO2理化性质与生理特性

1．3．2 低浓度SO2调控动、植物细胞生长发育

1．4 气体信号分子缓解铝胁迫的机制研究

1．4．1 Al对植物毒害作用的研究进展

1．4．2 气体信号分子缓解Al对植物胁迫的研究综述

1．5 课题研究的目的、意义及内容

1．5．1 研究的目的与意义

1．5．2 研究内容

第二章 SO2延缓小麦糊粉层细胞PCD的机制研究

2．1 材料试剂及设备

2．1．1 供试材料及处理

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 SO2处理小麦糊粉层细胞死亡率测定

2．2．2 小麦糊粉层细胞PSV液泡化及DNA提取

2．2．3 小麦糊粉层细胞可溶性蛋白含量测定

2．2．4 小麦糊粉层细胞ROS测定及定位

2．2．5 小麦糊粉层细胞抗氧化酶活性测定

2．2．6 小麦糊粉层细胞基因表达测定

2．2．7 小麦糊粉层原生质体的制备

2．2．8 小麦糊粉层细胞内源NO、H2S检测

2．2．9 小麦糊粉层细胞细胞死亡实验

2．2．10 小麦糊粉层抗氧化基因表达测定

2．2．11 小麦糊粉层内源H2S含量测定

2．2．12 统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 SO2延缓小麦糊粉层细胞程序性死亡进程

2．3．2 SO2延缓小麦糊粉层细胞PSV液泡化及DNA降解

2．3．3 SO2延缓小麦糊粉层可溶性蛋白含量降解

2．3．4 SO2降低小麦糊粉层细胞ROS含量

2．3．5 SO2调控小麦糊粉层细胞中的CAT、POD、APX、SOD、LOX和PPO活性

2．3．6 SO2调控小麦糊粉层细胞硫代谢相关基因及抗氧化相关基因表达

2．3．7 SO2促进小麦糊粉层细胞合成内源H2S、NO含量

2．3．8 SO2通过H2S与NO途径调控小麦糊粉层细胞死亡

2．3．9 SO2通过内源NO调控小麦糊粉层细胞抗氧化酶基因表达

2．3．10 内源NO与H2S信号分子联系

2．4 本章小结

第三章 SO2与H2S激活小麦种子淀粉酶的机制研究

3．1 材料、试剂与仪器

3．1．1 供试材料与方法

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 小麦种子总淀粉酶的制备与处理

3．2．2 小麦种子α／β-淀粉酶的制备与处理

3．2．3 自由态与结合态β-淀粉酶的制备与处理

3．2．4 淀粉酶的活性电泳测定

3．3 结果与讨论

3．3．1 H2S上调小麦种子总淀粉酶酶活

3．3．2 H2S调控小麦种子α／β-淀粉酶活性

3．3．3 H2S上调自由态β-淀粉酶活性

3．3．4 H2S与SO2上调小麦种子结合态β-淀粉酶活性

3．4 本章小结

第四章 SO2缓解铝胁迫下小麦胚根生长的机制研究

4．1 材料、试剂及设备

4．1．1 材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要设备仪器

4．2 试验方法

4．2．1 Al对小麦胚根生长的作用测定

4．2．2 SO2对小麦胚根生长作用检测

4．2．3 SO2预处理对Al胁迫小麦胚根生长作用的测定

4．2．4 胚根组织中活性氧检测

4．2．5 Evens blue染色及Hematoxylin染色

4．2．6 RT-PCR检测

4．2．7 qPCR检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 铝胁迫抑制小麦胚根生长及SO2对胚根生长的影响

4．3．2 SO2预处理缓解铝胁迫小麦胚根生长

4．3．4 SO2预处理缓解铝胁迫小麦胚根引起的膜损伤及减少铝含量

4．3．5 SO2预处理缓解铝胁迫诱导小麦胚根的氧化损伤

4．3．6 SO2调控铝胁迫的小麦胚根铝诱导基因的表达

4．4 本章小结

结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

硕士期间发表论文