Lux基因重组铜绿假单胞菌的发光特性、抑菌评估和生物膜形成机理探究

目录

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主要符号对照表

第一章 文献综述

1.1 生物发光简介

1.2 生物发光的分类

1.2.1 基于腔肠素的生物发光系统

1.2.2 基于海萤荧光素的生物发光系统

1.2.3 基于D-荧光素的生物发光系统

1.2.4 四吡咯类荧光素

1.2.5 真菌生物发光系统

1.2.6 细菌生物发光系统

1.3 细菌的lux基因

1.3.1 LuxCDABE

1.3.2 Lux基因的优缺点

1.3.3 Lux基因标记的微生物在食品工业研究中的应用

1.4 铜绿假单胞菌

1.4.1 铜绿假单胞菌概况

1.4.2 铜绿假单胞菌在食品和环境中的危害及其传播途径

1.4.3 细菌生物膜与胞外多糖

1.4.4 pslM/pelA/algA/algU/bdlA/ppyR与铜绿假单胞菌生物膜形成的关系

1.4.5 Lux基因在铜绿假单胞菌中的应用

1.5.1 研究的目的及意义

1.5.2 主要研究内容

1.5.3 技术路线

第二章 重组发光铜绿假单胞菌的构建

2.1材料与方法

2.1.1 供试菌株及质粒

2.1.2 试剂和培养基的配制

2.1.3 试验仪器与设备

2.1.4 菌种活化

2.1.5 铜绿假单胞菌抗性验证

2.1.6 pHSG396-luxCDABE质粒提取及验证

2.1.7 pbbr1mcs5-luxCDABE质粒的构建

2.1.8 TG1感受态细胞制备及CaCl2转化

2.1.9 pbbr1mcs5-luxCDABE的提取及验证

2.1.10 铜绿假单胞菌感受态细胞的制备及电转化

2.1.11 重组发光铜绿假单胞菌的验证

2.1.12 重组发光铜绿假单胞菌的筛选

2.1.13 数据统计分析

2.2 结果与分析

2.2.1 铜绿假单胞菌抗生素敏感性验证

2.2.1 pHSG396-luxCDABE载体的酶切验证

2.2.2 重组质粒pbbr1mcs5-luxCDABE的构建及验证

2.2.3 重组发光铜绿假单胞菌的构建及验证

2.2.4 重组发光铜绿假单胞菌的定量筛选

2.3 讨论

2.3.1 Lux基因导入铜绿假单胞菌质粒载体的选用

2.3.2 假单胞菌的宿主转化系统

2.4 本章小结

第三章 Lux基因在重组发光铜绿假单胞菌体内的异源表达

3.1.1 试验材料

3.1.2 试剂和培养基配制

3.1.3 试验仪器与设备

3.1.4 重组发光铜绿假单胞菌生长曲线和发光曲线的初测

3.1.5 温度对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.1.6 pH对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.1.7 NaCl浓度对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.1.8 IPTG浓度对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.1.9 癸醛浓度对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.1.10 重组发光铜绿假单胞菌的稳定性

3.1.11 数据统计分析

3.2 结果与分析

3.2.1 重组发光铜绿假单胞菌的生长曲线和发光曲线

3.2.2 温度对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.2.3 pH对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.2.4 NaCl浓度对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.2.5 IPTG对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.2.6 癸醛对重组发光铜绿假单胞菌的影响

3.2.7 重组发光铜绿假单胞菌的稳定性

3.3 讨论

3.3.1 影响lux基因在宿主体内表达的主要因素

3.3.2 重组发光菌稳定性研究

3.4 本章小结

第四章 PAO1-CE定量检测抑菌敏感物数学模型的建立

4.1.1 试验材料

4.1.2 试剂和培养基配制

4.1.3 试验仪器与设备

4.1.4 PAO1和PAO1-CE生长情况对比

4.1.5 PAO1-CE的细胞毒性检测及定量数学模型的建立

4.1.6 MIC

4.1.7 生长曲线模型

4.1.8 胞内ATP水平

4.1.9 细胞AKP酶活

4.1.10 细胞膜完整性

4.1.11 细胞外膜通透性

4.1.12 细胞内膜通透性

4.1.13 场发射扫描电镜

4.1.14 数据统计分析

4.2 结果与分析

4.2.1 PAO1和PAO1-CE生长曲线对比

4.2.2 PAO1-CE的细胞毒性检测及数学模型的构建

4.2.3 MIC验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.4 生长曲线模型拟合验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.5 胞内ATP测定验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.6 AKP酶活测定验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.7 细胞外膜通透性验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.8 细胞内膜通透性验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.9 细胞膜完整性验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.2.10 FESEM验证PAO1-CE对六种抗生素的敏感性

4.3 讨论

4.3.1 PAO1-CE与其他全细胞重组发光铜绿假单胞菌的比较

4.3.2 六种抗生素对铜绿假单胞菌的抑菌作用

4.3.3 PAO1-CE细胞毒性评价数学模型分析

4.5 本章小结

第五章 SAN和EGN对铜绿假单胞菌抑菌作用的评价

5.1.1 试验材料

5.1.2 溶液和培养基配制

5.1.3 试验仪器与设备

5.1.4 SAN和EGN对PAO1-CE的细胞毒性检测及数学模型的拟合

5.1.5 MIC

5.1.6 生长曲线模型

5.1.7 胞内ATP

5.1.8 细胞AKP酶活

5.1.9 细胞膜完整性

5.1.10 细胞外膜通透性性

5.1.11 细胞内膜通透性

5.1.12 FESEM

5.1.13 数据统计分析

5.2 结果与分析

5.2.1 SAN和EGN对PAO1-CE的细胞毒性

5.2.2 MIC

5.2.3 生长曲线模型

5.2.4 胞内ATP

5.2.5 AKP酶活

5.2.6 细胞外膜通透性

5.2.7 细胞内膜通透性

5.2.8 细胞膜完整性

5.2.9 FESEM

5.3 讨论

5.4 本章小结

第六章 铜绿假单胞菌生物膜形成能力的验证及对比

6.1.1 试验菌种

6.1.2 试剂和培养基配制

6.1.3 试验仪器与设备

6.1.4 铜绿假单胞菌生物膜培养模型优化

6.1.5 结晶紫染色法测定生物膜形成量

6.1.6 八种抑菌物质对铜绿假单胞菌亚致死浓度的测定

6.1.7 银染法观测铜绿假单胞菌生物膜形成量

6.1.8 场发射扫描电镜观测铜绿假单胞菌生物膜形成量

6.1.9 八种抑菌物质对铜绿假单胞菌生物膜形成量的影响

6.1.10 数据统计分析

6.2.1 铜绿假单胞菌生物膜培养模型优化

6.2.2 八种抑菌物质对铜绿假单胞菌亚致死浓度的测定

6.2.3 光学显微镜结果

6.2.4 FESEM结果

6.2.5 八种抑菌物质对铜绿假单胞菌生物膜形成量的影响

6.3 讨论

6.4 本章小结

第七章 Str和Car对铜绿假单胞菌生物膜抑制作用及探究

7.1.1 试验菌株

7.1.2 试剂和培养基配制

7.1.3 试验仪器与设备

7.1.4 生物膜定量检测

7.1.5 发光强度检测

7.1.6 特异性启动子-报道子法测定胞外多糖相关基因表达量

7.1.7 铜绿假单胞菌RNA的提取

7.1.8 反转录

7.1.9 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

7.1.10 数据统计分析

7.2 结果和分析

7.2.1 Str和Car浓度与IR%数学模型的拟合

7.2.2 Str和Car浓度与生物膜形成量数学模型的拟合

7.2.3 利用IR%预测铜绿假单胞菌生物膜形成量数学模型的构建

7.2.4 Str和Car抑制铜绿假单胞菌生物膜形成胞外多糖关键基因研究

7.2.5 RT-qPCR验证

7.3.1 Lux基因在铜绿假单胞菌生物膜研究中的应用

7.3.2 Str 和 Car 抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成与 pslM/pelA/algA/bdlA/ppyR表达的关系

7.4 本章小结

第八章 结论、创新点与展望

8.1 结论

8.2 创新点

8.3 展望

参考文献

附录A pHSG396-luxCDABE 载体中 luxCDABE 基因完整碱基序列（5798 bp）

附录B 六种抗生素作用 24 h 内铜绿假单胞菌发光曲线

致谢

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