声明
符号表
第1 章 文献综述
1.1 单增李斯特菌的概述
1.1.1 单增李斯特菌的特征
1.1.2 单增李斯特菌的免疫机制
1.1.3 单增李斯特菌作为肿瘤疫苗的研究进展
1.2 细胞自噬的概述
1.2.1 细胞自噬的过程
1.2.2 细胞自噬的生物学作用
1.2.3 细胞自噬的调控机制
1.2.4 细胞自噬的检测方法
1.2.5 细胞自噬在肿瘤发生中的作用
1.3 单增李斯特菌与细胞自噬
1.3.1 单增李斯特菌在宿主细胞内的识别过程
1.3.2 单增李斯特菌诱导宿主细胞自噬的发生
1.3.3 单增李斯特菌逃避自噬的研究
1.4 研究目的与意义
第2 章 LM 诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10 自噬的发生
2.1 试验材料
2.1.1 实验所需生物材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要试剂的配制
2.1.4 主要仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 LM的复苏及培养
2.2.2 B16F10 肿瘤细胞的复苏、培养及冻存
2.2.3 细菌及细胞浓度的确定
2.2.4 LM感染B16F10 肿瘤细胞
2.2.5 B16F10 细胞自噬相关基因表达水平的测定
2.2.6 Western blot 测定B16F10 细胞自噬标志性蛋白LC3 的表达
2.2.7 荧光显微镜观察B16F10 细胞自噬标志性蛋白LC3 的表达情况
2.2.8 透射电子显微镜观察B16F10 细胞内自噬小体的形成
2.2.9 统计与分析
2.3 试验结果与分析
2.3.1 B16F10 细胞自噬相关基因PCR 扩增的特异性分析
2.3.2 LM感染对B16F10 细胞内自噬基因mRNA 表达水平的影响
2.3.3 LM感染对B16F10 细胞内自噬标志物LC3 蛋白表达情况的影响
2.3.4 利用自噬LC3 双标腺病毒测定自噬发生的情况
2.3.5 透射电镜技术观察B16F10 细胞内的自噬现象
2.4 讨论
2.5 小结
第3 章 稳定沉默自噬调控基因Beclin-1 的B16F10 细胞株的构建及鉴定
3.1 试验材料
3.1.1 实验所需生物材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 试验方法
3.2.1 B16F10 细胞培养和处理
3.2.2 m-Beclin-1-shRNA 慢病毒载体的构建及质粒扩增
3.2.3 包装细胞株293T 细胞的培养
3.2.4 病毒包装
3.2.5 滴度检测
3.2.6 Beclin-1干扰稳定株的构建与筛选
3.2.7 qPCR 检测稳转细胞株的干扰效果
3.2.8 荧光显微镜观察稳转细胞系Beclin-1 蛋白的表达情况
3.2.9 稳转细胞系自噬标志性蛋白LC3 表达情况的测定
3.2.10 统计与分析
3.3 试验结果与分析
3.3.1 m-Beclin-1-shRNA 慢病毒载体的测序鉴定
3.3.2 病毒滴度的检测结果
3.3.3 Beclin-1干扰稳定株的筛选结果
3.3.4 B16F10 细胞总RNA纯度与浓度的鉴定
3.3.5 m-Beclin-1基因的mRNA 相对表达水平和特异性分析
3.3.6 稳转细胞系Beclin-1蛋白的表达量分析
3.3.7 Beclin-1沉默对自噬标志物蛋白LC3 表达情况的影响
3.4 讨论
3.5 小结
第4 章 自噬对LM 诱导B16F10 肿瘤细胞死亡的影响
4.1 试验材料
4.1.1 实验所需生物材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 试验方法
4.2.1 B16F10 细胞和LM 的培养和处理
4.2.2 B16F10 细胞自噬水平的检测
4.2.3 B16F10 细胞活力的检测
4.2.4 B16F10 细胞凋亡率的测定
4.2.5 LM 在B16F10 细胞内增殖情况的检测
4.2.6 统计与分析
4.3 试验结果与分析
4.3.1 氯喹和雷帕霉素对B16F10 细胞自噬的影响
4.3.2 自噬对LM诱导B16F10 肿瘤细胞死亡的影响
4.3.3 自噬对LM诱导B16F10 细胞凋亡的影响
4.3.4 自噬对LM 在B16F10 细胞内增殖的影响
4.4 讨论
4.5 小结
第5 章 自噬在LM 抗小鼠黑色素瘤中的作用机制
5.1 试验材料
5.1.1 实验所需生物材料
5.1.2主要试剂
5.1.3主要仪器
5.2 实验方法
5.2.1 B16F10 细胞和LM 的培养和处理
5.2.2 荷瘤小鼠模型的建立及免疫程序
5.2.3 肿瘤生长抑制情况测定
5.2.4 荷瘤小鼠的生存期测定
5.2.5 肿瘤组织细胞的凋亡水平测定
5.2.6 实体瘤组织内LM 载量的测定
5.2.7 统计与分析
5.3 试验结果与分析
5.3.1 自噬对LM抗小鼠黑色素瘤作用的影响
5.3.2 自噬对荷瘤小鼠生存期的影响
5.3.3 自噬对LM诱导肿瘤组织细胞凋亡的影响
5.3.4 自噬对实体瘤内LM载量的影响
5.4 讨论
5.5 小结
第6 章 结论
参考文献
致 谢
攻读硕士学位期间的研究成果
河南科技大学;
