菲律宾蛤仔黏附污泥中絮凝活性胞外多糖的提纯及结构表征

摘要

微生物絮凝剂是由细菌等微生物经过发酵提取所得到的的生物大分子，具有较好的絮凝效果，其成分主要包括多糖、蛋白质、核酸、纤维素等。菲律宾蛤仔粘附污泥(RPM)最近被报道为一种天然的高效生物絮凝剂，推测黏附污泥中的微生物是絮凝现象产生的原因。本文深入研究了三株絮凝活性菌株的胞外多糖聚合物，由于其良好的絮凝效果，采用多种手段对其结构进行了表征，并探讨其结构信息可能对絮凝效果产生的促进作用，因此，本文从筛选的菌株中做了以下工作:　　(1)微生物胞外多糖的提取纯化　　选取菌株，本文从实验室中初期筛选鉴定的絮凝活性菌株中选取三株Halomonas sp.GHF11、Pseudoalteromonas sp.GHS19和Pseudoalteromonas sp.JP，通过接种培养，用乙醇沉淀法获得多糖粗品。多糖粗品经过Sevag法脱蛋白处理后，经过阴离子交换柱DEAE和Sephadex凝胶渗透色谱柱进一步纯化得到多糖纯品。对获得的多糖纯品进行絮凝活性测试和结构信息的表征。　　(2)多糖纯品的活性测试　　对微生物多糖纯品的活性进行了探究，分析了不同浓度下多糖的絮凝活性和脱色活性的变化规律，找到了最佳活性的多糖浓度。结果表明在0.5mg/L的F11多糖剂量时，最佳絮凝效果达到71.2％，而在反应剂量小于0.1mg/L或大于1.0mg/L时，絮凝效果较差。另外，对F11多糖纯品关于三种染色剂包括甲基蓝、结晶紫、孔雀石绿的脱色效果进行了探究。结果显示，该多糖对于孔雀石绿的脱色效果最好，在反应剂量1.8mg/L时，达到最佳脱色效果92.4％。同样地，反应剂量过高或较少，脱色效果将逐渐减弱。同样地，S19多糖的絮凝活性与其剂量有着相似的关系。在剂量为0.9mg/L时，达到最佳絮凝率为78.8％，反应剂量为2.0mg/L时，有最佳脱色活性87.9％。JP多糖在投加剂量为0.8mg/L时，达到最佳絮凝率为83.5％，反应剂量为1.5mg/L时，有最佳脱色活性93.6％。　　(3)多糖结构的解析　　分离纯化的多糖经过一系列手段进行结构的表征。红外光谱显示该多糖的主要官能团，包括羟基、羰基、亚甲基、碳骨架环等。凝胶渗透色谱法测得F11和S19两多糖分子量分别为31KDa和1010KDa，使用高效液相色谱测得F11样品单糖组成为甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、核糖。利用气相质谱联用仪对多糖进行甲基化分析，总离子流图和质谱图显示，其糖苷键的连接方式有葡萄糖末端连接、葡萄糖1→2→3→4连接，甘露糖1→2→3→4→6连接。S19样品单糖组成为葡萄糖和甘露糖，甲基化分析显示，其糖苷键连接方式为葡萄糖Glc1→3连接、葡萄糖Glc1→4连接、葡萄糖G1c1→3→4连接以及甘露糖Man1→2→3→4→6连接。

目录

声明

摘要

第一章引言

1．1絮凝剂

1．1．1絮凝剂的分类

1．1．2絮凝剂的研究状况

1．2微生物絮凝剂的研究进展

1．2．1产絮凝微生物的研究状况

1．2．2微生物絮凝剂的组成研究

1．2．3微生物絮凝剂的制备研究

1．2．4微生絮凝剂的应用研究进展

1．2．5微生物絮凝剂活性机理研究

1．3微生物胞外多糖的研究

1．4．1微生物胞外多糖的提取

1．4．2微生物胞外多糖的纯化

1．4．3多糖的纯度鉴定

1．5微生物多糖的结构研究

1．5．1单糖组成分析

1．5．2红外光谱分析

1．5．3多糖的甲基化分析

1．5．4多糖的核磁共振分析

1．6课题的研究意义与研究内容

1．6．1课题研究意义

1．6．2研究内容

1．7课题研究的可行性

1．8课题研究的创新点

第二章Halomonas sp．GHF11菌株胞外多糖的提取纯化、结构表征

2．1材料和仪器

2．1．1材料与试剂

2．1．2仪器设备

2．2实验方法

2．2．1菌株胞外多糖粗品提取过程

2．2．2粗多糖脱蛋白处理

2．2．3柱层析

2．2．4总糖含量的测定

2．2．5Halomonas sp．GHF11菌株胞外多糖的纯化、结构表征

2．2．6胞外多糖活性的测定

2．3结果与讨论

2．3．1多糖纯度分析

2．3．2柱层析

2．3．3分子量和红外光谱

2．3．4单糖组成分析

2．3．5甲基化分析

2．3．6絮凝活性和脱色活性

2．4本章小结

第三章Pseudoalteromonas sp．GHS19菌株胞外多糖的提取纯化与结构表征

3．1材料和仪器

3．1．1材料与试剂

3．1．2仪器设备

3．2实验方法

3．2．1菌株胞外多糖粗品提取过程

3．2．2粗多糖脱蛋白处理

3．2．3柱层析

3．2．4总糖含量的测定

3．2．6胞外多糖活性的测定

3．3结果与讨论

3．3．1多糖纯度分析

3．3．2柱层析

3．3．3分子量和红外光谱分析

3．3．4单糖组成分析

3．3．5甲基化分析

3．3．6絮凝活性和脱色活性

3．4本章小结

第四章Pseudoalteromonas sp．JP菌株胞外多糖的提取纯化活性测定

4．1材料和仪器

4．1．1材料与试剂

4．1．2仪器设备

4．2实验方法

4．2．1菌株胞外多糖粗品提取过程

4．2．2粗多糖脱蛋白处理

4．2．3柱层析

4．2．4总糖含量的测定

4．2．5胞外多糖活性的测定

4．3结果与讨论

4．3．1多糖纯度分析

4．3．2柱层析

4．3．3活性分析

4．4本章小结

第五章结论与展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果