拟南芥bzip19/bzip23/bzip24/35S:PDR12材料的构建及其在铅胁迫下的表型研究

摘要

近年来，土壤重金属污染日益严重，特别是铅污染，土壤污染的铅离子通过生物链最终富集到人类的组织和器官中，对人类的健康够成了极大的威胁。如何根除或降低土壤铅污染已成为当前环境与食品科学研究领域的热点和难点之一。目前解决该问题的技术途径主要有:(1)通过植物修复等技术（包括植物修复基因工程）清除土壤铅污染;(2)通过农艺措施或转基因技术减少农作物可食部位的铅积累。然而，这项工作的关键点在于对植物耐受铅毒害及其富集的分子机理的认识以及关键基因的发掘。前期研究发现PDR12作为细胞质膜上的转运蛋白，能够将植物细胞中的重金属通过细胞质膜转运到细胞外来减少植物中重金属的含量，从而提高了植物对重金属的耐受性。bZIP类转录因子家族中bZIP19、bZIP23和bZIP24转录因子参与植物对铅的胁迫响应，且在转录水平上对PDR12基因的表达有显著的正调控作用。为了从遗传学角度证实PDR12基因是转录因子bZIP19、bZIP23、bZIP24的潜在靶基因，本研究构建了bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2/35S∶PDR12材料并进行了分析，获得了以下主要实验结果:
　　1、每个转录因子分别获得2个T-DNA插入突变体:bzip19-1、bzip19-2;bzip23-1、bzip23-2和bzip24-1、bzip24-2。分别从DNA水平、mRNA转录水平对突变体进行纯合体分离与鉴定。通过DNA测序和序列比对获得突变体中T-DNA的插入位点。并对其在铅胁迫下的表型进行分析。结合突变体在转录水平的基因表达，选出选出bzip19-2、bzip23-1和bzip24-2三个单突变体作为后续多突变体构建的原材料。
　　2、以拟南芥单突变纯合体zip19-2和bzip23-1作为亲本进行杂交，获得F1代种子，待种子成熟后进行干燥和春化，将F1代种子土培生长4w后提DNA进行PCR鉴定，获得bzip19-2/bzip23-1双突变杂合体。F1代植株自交后获得F2代种子，对F2代幼苗单株取样提DNA，并进行PCR鉴定，最终获得bzip19-2/bzip23-1双突变纯合体。
　　3、以单突变纯合体bzip24-2和双突变纯合体bzip19-2/bzip23-1作为亲本进行杂交，得F1代种子， F1代种子土培生长4w后提取幼苗DNA，并进行PCR鉴定，获得bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2三突变杂合体。F1代植株自交后获得F2代种子，待F2代种子生长4w后单株取样提取幼苗DNA，并进行PCR鉴定，最终获得bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2三突变纯合体。
　　4、以野生型拟南芥的cDNA为模板，结合相应的克隆引物扩增出PDR12基因CDS片段，并连接到pBI121植物表达载体上，构建获得35S∶PDR12载体。将构建好的重组载体转化至GV3101农杆菌中，通过花序侵染法侵染拟南芥野生型植株，通过转基因筛选以及DNA与RNA水平的鉴定获得35S∶PDR12植株，RT-PCR筛选获得理想株系用于后续实验。
　　5、以35S∶PDR12阳性纯合植株与bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2三突变纯合体作为亲本进行杂交，通过抗性筛选以及DNA水平鉴定，最终获得纯合的bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2/35S∶PDR12植株。
　　6、分析野生型WT、bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2三突变体、35S∶ PDR12过表达和bzip19-2/bzip23-1/bzip24-2/35S∶PDR12植株在正常条件和铅胁迫下的表型，从遗传学角度验证PDR12基因可能是bZIP19、bZIP23、bZIP24转录因子的潜在靶基因。

目录

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致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 模式植物拟南芥简介

1．2 重金属胁迫对植物的危害

1．3 植物对重金属胁迫的抗性机制

1．4 PDRI2／ABCG40基因对铅胁迫响应的研究进展

1．4．1 ABCG型转运蛋白的结构特点

1．4．2 PDRI2／ABCG40转运蛋白的功能研究

1．5 bZIP家族的研究进展

1．5．1 植物bZIP类转录因子的结构特点

1．5．2 植物bZIP类转录因子的功能研究

1．6 本研究的目的和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒

2．2 主要试剂

2．2．1 常用分子生物学试剂盒

2．2．2 常用酶类

2．2．3 常用生化试剂

2．2．4 常用溶液与试剂的配制

2．3 主要仪器与设备

2．4 实验方法

2．4．1 灭菌与消毒

2．4．2 拟南芥的种植与培养

2．4．3 根长和鲜重的测量

2．4．4 1．5×CTAB法提取植物全基因组DNA

2．4．5 Trizol法提取植物组织总RNA

2．4．6 全基因组cDNA合成

2．4．7 qRT-PCR

2．4．8 引物设计

2．4．9 PCR反应体系及程序

2．4．10 琼脂糖凝胶电泳检测核酸

2．4．11 PCR产物纯化(Kit)

2．4．12 琼脂糖凝胶电泳产物回收(Kit)

2．4．13 高纯度质粒DNA的提取(Kit)

2．4．14 酶切反应

2．4．15 T4连接反应(10ul连接体系)

2．4．16 大肠杆菌DH5α菌株相关实验

2．4．17 T载体PCR产物克隆(Kit)

2．4．18 农杆菌GV3101感受态的制备与转化

2．4．19 植物过表达载体的构建

2．4．20 花序侵染法转化拟南芥

2．4．21 拟南芥的杂交

2．4．22 实验数据处理及统计分析

第三章 实验结果与分析

3．1 拟南芥单突变体的分离与鉴定

3．1．1 拟南芥单突变纯合体的分离与鉴定

3．1．2 拟南芥单突变纯合体的表型鉴定

3．2 拟南芥bzip19-2／bzip23-1双突变体的分离与鉴定

3．2．1 拟南芥bzip19-2／bzip23-1双突变杂合体的获得与鉴定

3．2．2 拟南芥bzip19-2／bzip23-1双突变纯合体的分离与鉴定

3．3 拟南芥bzip19-2／bzip23-1／bzip24-2三突变体的分离与鉴定

3．3．1 拟南芥bzip19-2／bzip23-1／bzip24-2三突变杂合体的获得与鉴定

3．3．2 拟南芥bzip19-2／bzip23-1／bzip24-2三突变纯合体的分离与鉴定

3．3．3 拟南芥bzip19-2／bzip23-1三突变纯合体在铅胁迫下的表型分析

3．3．4 拟南芥突变体中PDR12基因的表达量分析

3．4 拟南芥35S：PDR12材料的构建

3．4．1 拟南芥中PDR12基因过表达载体的构建

3．4．2 拟南芥35S：PDR12植株的获得

3．5 拟南芥的bzip19-2／bzip23-1／bzip24-2／35S：PDR12材料构建

3．5．1 拟南芥的bzip19-2／bzip23-1／bzip24-2／35S：PDR12杂合植株的获得与鉴定

3．5．2 拟南芥的bzip19-2／bzip23-1／bzip24-2／35S：PDR12纯合植株的分离与鉴定

第四章 讨论与展望

4．1 结果与讨论

4．2 后期工作展望

参考文献

攻读硕士学位其间的学术活动及成果情况