中华蟾蜍与日本蟾蜍皮肤galectin-3cDNA的克隆、序列分析与原核表达

摘要

galectin-3作为多功能的β-半乳糖结合蛋白，其抑制剂被认为是一种新型的抗肿瘤药物。其中，由108-250位氨基酸组成的N末端截短型人galectin-3(galectin-3C)因抗肿瘤效果良好且无毒副作用，被考虑作为相对安全可靠的抗癌药物，但需作更进一步的研究。本研究选用中华蟾蜍与日本蟾蜍皮肤为研究对象，克隆并分析了两者galectin-3基因的cDNA序列，构建的原核表达重组质粒为进一步研究galectin-3C生物学功能及其应用奠定了基础。具体结论如下:　　 1、以日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库为模板筛选出5条galectin-3全长cDNA序列(登录号为JQ765589-JQ765593)，随后以中华蟾蜍皮肤总RNA反转录第一链cDNA为模板，克隆galectin-3ORF序列至pGM-T载体，测序后确认获得9个cDNA克隆(X1-2登陆号为AEX58672.1)。其中3条(3/14)序列为N末端缺失突变体。　　 2、利用生物信息学软件进行序列分析，结果表明:①同一个体的蟾蜍皮肤galectin-3cDNA呈现序列多态性，中华蟾蜍galectin-3C区域具有高密度的单核苷酸多态性(SNP)，每20bp出现1个SNP。，推测该多态性可能有益于蟾蜍个体应对复杂多变的环境，增强其对环境的适应能力;②预测中华蟾蜍galectin-3蛋白在Ser6、Ser186有潜在的丝氨酸磷酸化位点，N末端缺乏信号肽和跨膜结构域，主要定位于胞核、细胞质，属于胞内蛋白。中华蟾蜍galectin-3具有与人类同源蛋白相似的结构特征;⑧依据与一些哺乳动物的galectin-3具有相同的磷酸化位点、糖基结合位点和相关基序，预测中华蟾蜍galectin-3具有Ser6磷酸化与CRD糖基结合功能。　　 3.根据生物信息学分析结果设计引物，使用pET-28b(+)载体构建三种不同长度galectin-3C的原核表达重组质粒，优化重组蛋白诱导表达条件。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

1．1 凝集素概述

1．1．1 命名

1．1．2 分类

1．2 galectin-3

1．2．1 galectin-3的基因、蛋白结构

1．2．2 galectin-3的组织分布与表达

1．2．3 galectin-3糖基结合位点分析

1．2．4 galectin-3的磷酸化

1．3 galectin-3与肿瘤

1．3．1 galectin-3在肿瘤细胞凋亡中的作用

1．3．2 galectin-3在肿瘤细胞转移中的作用

1．4 galectin-3C的研究进展

1．4．1 galectin-3抑制剂

1．4．2 galectin-3C的研究进展

第二章 蟾蜍galectin-3基因全长ORF的克隆、鉴定

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 大肠埃希菌菌株与cDNA质粒文库

2．1．3 质粒

2．1．4 培养基及抗生素

2．1．5 主要试剂的配制

2．1．6 工具酶及其他试剂

2．1．7 主要实验仪器

2．2 方法

2．2．1 日本蟾蜍galectin-3克隆

2．2．2 中华蟾蜍galectin-3克隆

2．3 结果与分析

2．3．1 日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库盲筛结果

2．3．2 中华蟾蜍皮肤总RNA的提取

2．3．3 中华蟾蜍皮肤galectin-3 PCR扩增结果

2．3．4 重组质粒的鉴定

2．3．5 测序结果

2．4 讨论

2．4．1 蟾蜍组织的选择

2．4．2 EcoR I的双酶切

2．4．3 ORF分析

第三章 中华蟾蜍galectin-3序列的生物信息学分析

3．1 材料

3．1．1 序列来源

3．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 中华蟾蜍galectin-3核苷酸多样性分析

3．3．2 日本蟾蜍galectin-3分子多样性分析

3．3．3 galectin-3氨基酸位点突变

3．3．4 galectin-3编码蛋白一级结构序列分析

3．3．5 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析

3．3．6 galectin-3蛋白质的二级结构预测

3．3．7 galectin-3蛋白质的立体结构预测

3．3．8 galectin-3蛋白质的功能结构域分析

3．4 讨论

3．4．1 galectin-3 N末端缺失突变体与galectin-3抑制剂开发

3．4．2 蟾蜍皮肤galectin-3序列多态性的真实性

3．4．3 蟾蜍皮肤galectin-3序列多态性的分子形成机制

3．4．4 蟾蜍皮肤galeetin-3序列多态性的生物学适应意义

3．4．5 蟾蜍皮肤galectin-3分子多样性与中性学说

3．4．6 蟾蜍皮肤galectin-3的结构与功能预测

第四章 中华蟾蜍galectin-3基因及其3种galectin-3 C基因的亚克隆与原核表达载体构建

4．1 材料

4．1．1 质粒

4．1．2 大肠埃希菌菌株

4．1．3 培养基及抗生素

4．1．4 主要试剂的配制

4．1．5 工具酶及其他试剂

4．1．6 主要实验仪器

4．2 方法

4．2．1 galectin-3C序列的设计

4．2．2 引物设计

4．2．3 galectin-3与galectin-3C的亚克隆

4．2．4 PCR产物纯化

4．2．5 双酶切

4．2．6 酶切产物凝胶回收及纯化

4．2．7 表达载体pET-28b的制备

4．2．8 表达载体的构建和鉴定

4．2．9 序列测定

4．3 结果与分析

4．3．1 PCR纯化结果

4．3．2 目的片段与载体酶切后结果

4．3．3 表达载体的菌落PCR鉴定和双酶切鉴定

4．3．4 DNA测序

4．4 讨论

4．4．1 原核表达载体的选用

4．4．2 原核表达载体的构建

第五章 原核诱导表达条件优化

5．1 材料

5．1．1 培养基及抗生素

5．1．2 大肠埃希菌菌株及其他试剂

5．1．3 主要试剂的配制

5．1．4 主要实验仪器

5．2 方法

5．2．1 重组质粒转化

5．2．2 重组蛋白的诱导表达及其条件优化

5．2．3 SDS-PAGE电泳及染色

5．3 结果与分析

5．2．1 重组质粒在大肠埃希菌中的表达

5．2．2 诱导时间对重组质粒表达的影响

5．3 讨论

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

附录一：缩写词英汉对照

附录二：ORF Finder分析结果

作者简介

致谢