葛根素抑制SLE外周血淋巴细胞P-gp表达以及对糖皮质激素干预效应的影响

摘要

目的：探讨葛根素对系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者外周淋巴细胞P-gp的干预作用以及对糖皮质激素干预效应的影响，为提高SLE临床疗效提供新思路和新方法。　　方法：1.利用淋巴细胞分离液分离培养健康志愿者外周血淋巴细胞，用小剂量甲基强的松龙（2μg/ml）诱导其耐药，流式细胞术检测细胞 P-gp表达、罗丹明-123（R-123）在细胞中的积累，并分析其与甲基强的松龙诱导的细胞凋亡率、CD69抑制率的相关性。2.以四唑盐比色法（MTT）筛选葛根素和维拉帕米对淋巴细胞的非细胞毒浓度。淋巴细胞分离液分离培养SLE患者外周血淋巴细胞，用含有葛根素的培养液孵育，以维拉帕米作为阳性对照组，流式细胞术检测葛根素对SLE患者淋巴细胞P-gp表达、R-123积累的影响。3.用植物凝集素 PHA活化淋巴细胞，并用流式细胞术检测葛根素与大剂量甲基强的松龙（200μg/ml）联合干预对细胞AnnexinⅤ（％）和CD69荧光强度的影响。　　结果：1.小剂量甲基强的松龙(2μg/ml)诱导可使淋巴细胞P-gp表达、R-123积累率显著增高，诱导的淋巴细胞在大剂量甲基强的松龙(200μg/ml)的干预下，表现出抑制细胞活化（CD69荧光强度）与诱导细胞凋亡效应低下，该作用与错误!链接无效。呈负相关、与R-123积累率呈正相关；2.葛根素干预72小时可显著下调SLE患者外周血淋巴细胞P-gp表达，增加R-123在细胞中的积累，维拉帕米可显著增加细胞中R-123的积累，但对P-gp表达无显著影响；3.葛根素干预可显著增强甲基强的松龙诱导淋巴细胞凋亡和抑制CD69的效应。　　结论：P-gp的高表达可显著降低甲基强的松龙诱导淋巴细胞凋亡效应和抑制淋巴细胞活化作用；葛根素可显著下调SLE外周血淋巴细胞P-gp表达和转运活性，增强甲基强的松龙诱导淋巴细胞凋亡和抑制淋巴细胞活化作用。研究结果提示葛根素能在一定程度上逆转SLE患者P-gp介导的激素耐药，提高激素治疗的敏感性。其作用机理可能是下调P-gp的表达及抑制P-gp转运活性。

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前言

一、材 料 和 方 法

（一）试剂与材料

1．药物及试剂

2．实验材料

3．主要仪器和设备

（二）实验方法和步骤

1．外周血淋巴细胞分离培养

2．小剂量甲基强的松龙诱导健康志愿者淋巴细胞获得耐药性

3．流式细胞术检测分离培养的淋巴细胞P-gp表达

4．罗丹明积累实验检测淋巴细胞P-gp的转运活性

5．流式细胞术检测大剂量甲强龙诱导的淋巴细胞凋亡率

6．植物凝集素PHA活化淋巴细胞及甲基强的松龙的干预

7．流式细胞术检测淋巴细胞CD69荧光强度

8．MTT实验筛选葛根素、维拉帕米的干预浓度

9．MTT实验筛选甲基强的松龙诱导淋巴细胞凋亡的干预浓度

10．葛根素对SLE淋巴细胞P-gp表达的影响

11．葛根素对SLE淋巴细胞R-123积累的影响

12．葛根素对甲基强的松龙诱导SLE淋巴细凋亡的影响

13．葛根素对甲基强的松龙抑制SLE淋巴细胞CD69表达的影响

(三)数据统计

二、结果

（一）甲基强的松龙抑制外周血淋巴细胞活化及诱导细胞凋亡效应与P-gp的关系

1．2μg/ml甲基强的松龙诱导健康志愿者淋巴细胞获得P-gp介导的耐药性

2．大剂量甲基强的松龙抑制淋巴细胞CD69表达及诱导细胞凋亡效应

3．200μg/ml甲基强的松龙诱导淋巴细胞凋亡效应与P-gp表达的关系

4．200μg/ml甲基强的松龙诱导淋巴细胞凋亡效应与P-gp转运活性的关系

5．200μg/ml甲基强的松龙抑制淋巴细胞CD69表达与P-gp表达的关系

6．200μg/ml甲基强的松龙抑制淋巴细胞CD69表达与P-gp转运活性的关系

（二）葛根素对SLE外周血淋巴细胞P-gp表达、转运及其介导的激素耐药的干预作用

1.药物浓度筛选

2．葛根素对SLE患者外周血淋巴细胞P-gp表达的干预作用

3．葛根素对SLE患者外周血淋巴细胞罗丹明-123积累的影响

4．葛根素对甲基强的松龙诱导SLE淋巴细胞凋亡作用的影响

5．葛根素对甲基强的松龙抑制SLE淋巴细胞CD69表达的影响

三、分析与讨论

（一）多药耐药与P-糖蛋白概述

（二）P-gp影响SLE临床疗效的耐药机制

（三）葛根素对SLE淋巴细胞P-gp表达及其介导的激素耐药的影响

（四）葛根素逆转SLE患者外周血淋巴细胞激素耐药的机制与传统P-gp竞争性逆转剂的差异

结论

参考文献

致谢

文献综述 ;葛根素的研究进展概况