雌激素受体基因多态性与女性Graves眼病的关系研究

摘要

目的:　　 1.分析雌激素受体α(ERα)基因XbaI和PvulI酶切多态性和雌激素受体β(ERβ)基因RsaⅠ和AluⅠ多态性对女性Graves眼病患者的遗传影响。　　 2.研究不同ER-α基因XbaⅠ位点基因型下女性Graves病患者（包括Graves眼病患者）外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量和雌二醇(E2)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及甲状腺功能的异同。　　 3.通过对女性GO患者治疗前后其外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)中ERα和FoxP3基因的表达水平的检测，并与正常人群做比较分析，并以雌激素受体α基因XbaⅠ位点的3个基因型分为3组，进行组间的对比，观察ERα基因XbaⅠ多态性对ERα及FoxP3mRNA表达的影响，探讨ER-α基因XbaⅠ多态性在女性GO发病机制中的作用。　　 方法:　　 1.设立4组观察对象。分别为正常女性组，共126人;GD组，确诊为GD18个月以上，未出现眼征患者，共67人;GO-S组，诊断为GD后，18个月内出现眼征患者，共56人;GO-L组，诊断为GD后，18个月以上出现眼征患者，共40人;应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)的方法，检测受试对象ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ位点、ERβ基因RsaⅠ和AluⅠ位点多态性分布的情况;分析ERα基因与ERβ基因多态性与女性GO发病之间的相关关系。　　 2.选取月经周期正常的初发女性GD患者72人，其中包括有眼征患者22人，同时选取月经正常的女性50人作为对照组，在月经期的卵泡期（月经后3-7天）采取空腹静脉血，采用电化学发光测试仪测定E2、TSH、FT3、FT4、TPOAb、TGAb;化学发光法测定TRAb;流式细胞仪测定外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中IL-10、TGF-β1、TNF-α的含量。以ER-α基因XbaⅠ位点基因型分为三组，比较三组上述指标的差异。　　 3.选取女性活动性GO患者84名，泼尼松进行治疗，在治疗前后分别记录临床活动期评分（clinicalactivityscore，CAS），E2浓度，并分离新鲜外周血单个核细胞，提取总RNA，利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法逆转录并扩增ERα及FoxP3mRNA，通过凝胶图像系统对PCR产物的电泳条带进行扫描半定量分析。将84名患者以ER-α基因XbaⅠ多态位点的不同，分为三组，分别进行对比。　　 结果:　　 1.GO-S组AA基因型频率为80.4％，而正常对照组、GD组、GO-L组AA基因型频率分别为46.8％、59.1％和57.5％，差异有统计学意义(P=0.005)。并且，GO-S组与正常对照组、GD组、GO-L组差异具均有统计学意义(P值分别为0.000，0.04，0.042);将GD组、GO-S和GO-L合并与正常对照组相比较，AA基因型频率差异分为为66％和46.8％，差异具有统计学意义(P=0.004);GO-S组与GD组、GO-L组A等位基因频率分别为88.4％、75.4％和59.4％，计算暴露于A等位基因与GO-S的联系强度OR得出，GO-S组与GD组相比，暴露于A等位基因的OR(95％CI)为2.11(1.203-3.699)，与GO-L相比，暴露于A等位基因的OR(95％CI)为2.45(1.312-4.575);正常对照组、GD组、GO-S组和GO-L组在PvuⅡ多态性的分布差异不具有统计学意义(P=0.698);ERβ基因AluⅠ位点多态性的分布中，正常组、GD、GO-S和GO-L4组AA基因型分布总体差异有统计学意义(P=0.032)，其A等位基因频率分布总体差异也具有统计学意义(P=0.016)。GD、GO-S和GO-L3组间差异无统计学意义(P=0.910);GD、GO-S和GO-L3组数据合并，与正常对照组组进行统计学分析，其差异具有统计学意义(P=0.001)。计算暴露于A等位基因与GD的联系强度OR得出，与正常对照组相比，暴露于A等位基因的OR(95％CI)为1.71(1.272-2.299);正常对照组、GD组、GO-S组和GO-L组在AluⅠ多态性的分布差异不具有统计学意义(P=0.836)。　　 2.对照组中，不同基因型人群其外周血的TSH、FT3、FT4、TPOAb、TGAb、TRAb、E2、CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞及IL-10、TGF-β1、TNF-α的含量差异均无统计学意义;GD组中，不同基因型人群其外周血的TSH、FT3、FT4、TPOAb、TGAb、TRAb、E2和TGF-β1的含量差异无统计学意义;GD组的E2、TNF-α的含量显著大于正常对照组(P=0.000)，CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量显著少于正常对照组(P=0.000);GD组中，以GG基因型、GA基因型和AA基因型分为3组，GG组CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量最多，AA组最少，差异具有统计学意义(P=0.015);GG组IL-10含量最多，AA组最少，差异具有统计学意义(P=0.004);GG组TNF-α含量最少，AA组最多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.治疗前，CAS评分及E2浓度在GG、GA和AA基因型组间差异无统计学意义（P=0.684和P=0.714），治疗后，CAS评分及E2浓度均有下降，但GG组下降幅度最大，AA组较少，差异具有统计学意义(P=0.028);E2浓度差异无统计学意义(P=0.778);治疗前，GO组ERαmRNA表达明显高于对照组(P＜0.05)，GG组高于GA组和AA组，差异具有统计学意义（P=0.029和0.002），治疗后，GO组ERαmRNA表达明显下降(P＜0.05)，GG组高于GA组和AA组，差异具有统计学意义（P=0.039和0.014）;治疗前，GO组FoxP3mRNA表达明显低于对照组(P＜0.05)，GG组高于GA组和AA组，差异具有统计学意义(P=0.039)，治疗后，GO组FoxP3mRNA表达与治疗前相比明显上升(P＜0.05)，GG组高于AA组，差异具有统计学意义(P=0.002)。　　 结论:　　 1.在ERα基因XbaⅠ位点多态性方面，AA基因型与GD的发生有关，是GD的易感基因型，并且与GO的发生时间有着密切关系，是GO早发的危险因素;在ERβ基因AluⅠ位点多态性方面，等位基因A是GD的易感基因，AA基因型是GD的易感基因型，不是GO早发的危险因素;ERα基因PvuⅡ酶切位点多态性及ERβ基因RsaⅠ位点多态性与GO的发生发展无关。　　 2.ER-α基因XbaⅠ基因位点A等位基因的出现增多，抑制炎症因子IL-10减少，促炎因子TNF-α增多，最终导致AA基因型组CD4+CD25+Foxp3+Treg数量最少，而GG基因型组抑制炎症因子IL-10较多，促炎因子TNF-α较少，CD4+CD25+Foxp3+Treg数量最多，AA基因型组的免疫抑制力较差，可能导致了携带该基因型患者GO早发的几率增大。　　 3.随着等位基因G的增多，ER-αmRNA和Foxp3mRNA也相应增多，治疗效果相对较好，G等位基因是保护性基因。可能由于ERα基因XbaI位点多态性导致的ER受体数量不同，影响E2促进Treg发挥免疫抑制功能，而使泼尼松治疗活动性GO患者的效果存在差异。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、雌激素受体基因多态性与女性GO患者的相关研究

1．1 对象与方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 实验仪器及试剂

1．1．3 实验方法

1．1．4 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 对照组及实验组人群基本情况

1．2．2 PCR扩增ERα及β产物检测

1．2．3 ERα及β酶切产物检测

1．2．4 经基因测序检测突变点

1．2．5 各组基因多态性位点的分布

1．3讨论

1．4小结

二、雌激素受体α基因Xba Ⅰ位点多态性对女性GD(GO)患者调节性T细胞的影响

2．1 材料和方法

2．1．1 研究对象

2．1．2 标本采集

2．1．3 实验方法

2．1．4 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 ERa基因Xba Ⅰ位点(rs9340799)多态性在对照组、GD组中的分布

2．2．2 对照组、GD组外周血中TSH、FT3、FT4、TPOAb、TGAb和TRAb的含量

2．2．3 对照组、GD组外周血中CD4+CD25+FoxP3+及E2的含量

2．2．4 对照组、GD组外周血中IL-10、TGF-β1和TNF-α含量

2．3讨论

2．4小结

三、雌激素受体α基因Xba Ⅰ位点多态性对女性GO患者ER-α及FoxP3mRNA表达和治疗效果的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 研究对象

3．1．2 用药方案

3．1．3 检测方法及检测指标

3．1．4 ER-α和FoxP3的mRNA的表达检测的主要实验仪器

3．1．5 主要实验试剂

3．1．6 主要试剂的配制

3．1．7 实验步骤

3．1．8 ER-α基因XbaⅠ多态性分析

3．1．9 统计分析

3．2 结果

3．2．1 GO患者的PBMCs ER-αXbaⅠ多态性分析

3．2．1 治疗前后CAS评分、E2浓度的变化

3．2．2 治疗前后ER-αmRNA变化情况

3．2．3 治疗前后FoxP3mRNA变化情况

3．3讨论

3．4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 甲状腺相关性眼病免疫遗传学的研究进展

致谢