活体成像技术评价脂质体介导的乳腺癌基因治疗

摘要

研究背景：随着近年来乳腺癌的发病率持续增长，病死率居高不下，寻求一种新的有效的肿瘤治疗手段，已成为乳腺癌治疗研究领域亟需解决的问题。自杀基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)在抗肿瘤研究中有较大的应用价值。阳离子脂质体作为一种非病毒基因载体，能够有效的促进体内和体外基因的转染，具有基因负载量高，安全性好等优势，已成功的应用于体内基因转移和肿瘤治疗的研究中。然而，对于阳离子脂质体在活体生物体内介导外源性基因转移的行为，尚缺乏有效的追踪监测平台以及准确评价转染效率的技术手段。而基于分子影像技术的活体成像系统，具有无创伤性、可视性和量化的特点，可以填补这一研究方法的空白。以荧光素酶报告基因为基础的小动物活体成像，可以用来标记肿瘤细胞，随后追踪标记的肿瘤细胞在动物体内的命运；也可以用来标记研究的目的基因，观察活体动物体内基因的表达。当对两种或以上的荧光素酶报告基因同时或先后进行活体成像时，则可在同一时间段内观察到同一个体体内发生的两种以上的生物学过程。这种基于双报告基因或多报告基因的荧光素酶活体成像技术，为我们在本研究中评价阳离子脂质体介导的体内基因转移效率及探索其在肿瘤治疗中的应用，评价自杀基因对肿瘤的治疗作用等提供了潜在的平台。　　 研究目的：我们采用活体成像技术，目的在于跟踪监测移植的乳腺肿瘤细胞在小鼠体内的命运，观察移植瘤的生长、衰退和对治疗的反应，并评价阳离子脂质体介导的TK自杀基因在肿瘤组织内的基因转染效率，以及脂质体介导的TK自杀基因治疗对乳腺癌的抗肿瘤效果。我们同时探索萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶双报告基因的活体成像技术在研究肿瘤的治疗效果和评价脂质体基因传递效率等多方面的应用价值。　　 研究方法：首先为了验证直接注射到组织内的质粒DNA的表达状况，和探索阳离子脂质体促进DNA体内转染的作用，我们在BALB/c小鼠后肢进行肌肉内注射：右侧后肢肌肉内注射阳离子脂质体和Rluc-RFP-TIK质粒DNA(表达海肾荧光素酶-红色荧光蛋白-截短的胸腺嘧啶核苷激酶融合蛋白)的混合物，左侧注射用PBS稀释的同质量的Rluc-RFP-TTK质粒DNA。每隔一周进行Rluc信号的活体成像，观察基因的表达。然后，我们通过慢病毒转染技术，使用一个表达融合蛋白(增强的绿色荧光蛋白-萤火虫荧光素酶)的报告基因质粒eGFP-Fluc(DF)标记BALB/c小鼠来源的乳腺癌细胞系4T1，经过流式细胞仪筛选GFP阳性细胞群，得到稳定表达eGFP-Fluc的4T1细胞(4T1-DF)。将4T1-DF细胞以5×105/接种部位的细胞数注射接种至雌性BALB/c小鼠肩部两侧皮下，使其成瘤。从接种的第2天起，每隔4天，重复进行Fluc的小鼠活体成像，观察肿瘤的生长状况，直到体内实验结束。在肿瘤细胞接种一周后，连续重复3次进行肿瘤内基因注射治疗：每只荷瘤小鼠的一侧肿瘤内给予阳离子脂质体和Rluc-RFP-TTK质粒DNA的混合物，另一侧给予以PBS稀释的相等质量的Rluc-RFP-TTK质粒DNA。在3天后开始每天腹腔给予更昔洛韦药物。自肿瘤内基因注射第2天开始，每隔4天进行Rluc的小鼠活体成像观察Rluc-RFP-TTK质粒的表达。在持续给予更昔洛韦药物约半个月后，分离肿瘤组织，进行冰冻切片，用免疫荧光检测肿瘤组织内的RFP蛋白表达，TUNEL检测肿瘤组织内的凋亡，和用CD31抗体对肿瘤内的血管内皮细胞染色观察肿瘤内血管新生情况。结果：我们发现，单纯质粒注射可以在肌组织细胞内表达相应蛋白，表达持续的时间至少在一个半月，阳离子脂质体与质粒混合注射可以显著提高这种质粒DNA的转染效率从而提高表达水平。4T1-DF乳腺癌模型的自杀基因治疗实验中，我们发现在有脂质体介导的基因转移组肿瘤内Rluc信号强度要明显高于无脂质体介导的DNA转移组(对照组)；脂质体介导的TTK自杀基因治疗使移植瘤缩小的程度和阻抑肿瘤生长的程度要远远高于对照组；对肿瘤组织切片的RFP免疫荧光染色发现在脂质体介导的TTK自杀基因治疗组的肿瘤组织内，RFP表达明显较多；TUNEL凋亡染色提示肿瘤组织内有凋亡的发生，脂质体介导的TTK自杀基因治疗组的肿瘤内凋亡细胞的比例明显高于对照组；对肿瘤内CD31的荧光染色说明，肿瘤内血管新生的数量在脂质体介导的TTK自杀基因治疗组内较对照组有所下降。　　 结论：基于双报告基因的活体成像是研究脂质体介导的肿瘤基因治疗、评估阳离子脂质体基因转移效率的有效工具。eGFP-Fluc双融合报告基因用于标记肿瘤细胞和追踪肿瘤细胞在体内的命运，Rluc-RFP-TTK三重融合基因分别以Rluc信号和RFP来报告TTK自杀基因在肿瘤内的表达，都是可用于肿瘤治疗研究的重要手段。阳离子脂质体介导的TTK自杀基因治疗在小鼠乳腺癌移植瘤模型中表现出明显的抗肿瘤效果；阳离子脂质体能显著提高体内基因转移效率；TTK自杀基因的抗肿瘤作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤内血管新生等机制完成的。