重组人内抑素诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的作用及机制

摘要

目的：进一步明确重组人内抑素 (recombinant human endostatin，rh-End) 对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠继发性炎症的治疗作用；从滑膜细胞增殖与凋亡、滑膜细胞分泌功能、新生血管生成等方面，研究rh-End对AA大鼠治疗作用可能的环节；阐明rh-End抑制AA大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS) 异常增殖及诱导凋亡的作用，分析rh-End诱导滑膜细胞凋亡的机制。 方法：大鼠左侧后足跖皮内注射弗氏完全佐剂 (Complete Freund′s Adjuvant，CFA)0.1ml 致炎，造成佐剂性关节炎大鼠模型，rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg<'-1>·d<'-1>)皮下注射给药，观察大鼠全身状况，足容积法测量继发侧足肿胀度，进行多发性关节炎评分，光学显微镜观察关节病理变化；胶原酶．胰蛋白酶消化法、组织块移植法分离培养滑膜细胞，光镜、透射电镜分析滑膜细胞形态学的改变，MTT法检测滑膜成纤维细胞的增殖反应；琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色及Annexin V/PI双染色法观察成纤维滑膜细胞的凋亡；放免法检测IL-1β 13、TNF-α含量；实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA、PDGF mRNA、FGF mRNA及TNF-α mRNA的表达。 结果： 1．rh-End对AA大鼠继发性关节炎、关节病理的影响 AA大鼠致敏后10d左右出现炎症反应，多发性关节炎指数较高，表现为对侧和前肢足爪肿胀，耳、尾出现炎性结节和红斑并伴有体重下降。与正常大鼠相比，光镜下可见AA模型组大鼠的滑膜组织中滑膜细胞增生明显，炎性细胞浸润及血管翳形成，软骨中炎性细胞浸润，破坏软骨组织，同时还可见滑膜细胞的脂肪变性。rh-End治疗组可不同程度改善以上变化。 2.rh-End对AA大鼠滑膜细胞增殖与凋亡的影响 AA大鼠表现为滑膜细胞增殖功能亢进，rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg<'-1>) 体内治疗给药及rh-End 6.25～50 μg·ml<'-1>浓度范围体外给药可显著抑制 AA 大鼠成纤维细胞的增殖反应。rh-End体内用药可诱导AA大鼠滑膜组织及细胞的凋亡，rh-End体外用药作用48h，Annexin V/PI双染色法观察到AA FLS凋亡率为3.32％，rh-End(25mg·L<'-1>)可诱导AA FLS的凋亡，其凋亡率为6.67％，说明异常增生的滑膜细胞可能是rh-End的另一个作用靶点。结合体内外实验，表明rh-End可能通过抑制滑膜细胞增殖，促进凋亡从而起到对AA大鼠滑膜炎的治疗作用。 3.rh-End对AA大鼠滑膜细胞分泌功能的影响 rh-End治疗给药可纠正AA大鼠关节滑膜细胞的超微结构改变：A型滑膜细胞线粒体和空泡显著增多，线粒体肿胀、嵴突破坏或消失；B型滑膜细胞粗面内质网显著增加，网池显著膨胀及结构破坏，致密体数量显著增加。rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg<'-1>)均可不同程度抑制AA大鼠滑膜细胞的IL-1α、TNF-α含量；rh-End可降低AA大鼠滑膜组织TNF-α mRNA表达水平，显著抑制AA大鼠滑膜细胞分泌TNF-α，表明rh-End减轻滑膜细胞亢进的分泌功能是其保护软骨的重要方面。 4.rh-End对AA大鼠滑膜组织促血管生成因子mRNA基因表达的影响 rh-End体内给药可明显降低AA大鼠滑膜组织中PDGF、FGF以及VEGFmRNA基因的高表达水平，提示rh-End能对抗PDGF、FGF、VEGF 等新生血管生成刺激因子的促血管内皮细胞活性，抑制新生血管生成，从而抑制滑膜血管翳的侵蚀性，减轻AA的滑膜炎症和骨质破坏。 结论： 1．rh-End对大鼠AA多发性关节炎、关节局部肿胀及病理形态等具有明显的改善作用，且rh-End可不同程度抑制FLS亢进的增殖反应，同时诱导其凋亡的发生，减轻AA大鼠增生性滑膜炎。 2．rh-End可保护滑膜细胞具有分泌功能细胞器的超微结构，减轻AA大鼠滑膜细胞亢进的分泌功能，使滑膜细胞分泌IL-1β、TNF-α水平恢复正常。 3．抑制新生血管生成是rh-End治疗AA大鼠继发性关节炎的主要机制之一，rh-End可抑制AA大鼠滑膜组织中新生血管数量，同时可使滑AA大鼠滑膜组织中PDGF、FGF、VEGF mRNA基因的表达水平降低。 4．异常增生的AA滑膜细胞可能是内抑素作用的另一个重要靶点。

目录

论文说明:英文缩略词表

声明

摘要

1 前言

2 实验材料

2.1 动物

2.2 药物和试剂

2.3 仪器与设备

3 实验方法

3.1 重组人内抑素(recombinant human endostatin,rh-End)对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠继发性炎症的作用

3.1.1 AA大鼠模型的诱导

3.1.2 动物分组及给药方案

3.1.3 关节肿胀度测定

3.1.4 多发性关节炎指数(polyarthritis indes,PI)评分

3.1.5 关节滑膜组织病理组织学检查

3.1.6 透射电镜检查滑膜细胞超微结构

3.2 大鼠滑膜细胞的分离、培养与鉴定

3.2.1 大鼠滑膜组织的采集

3.2.2 胶原酶-胰蛋白酶消化法

3.2.2 组织块培养法

3.2.3 滑膜细胞的鉴定

3.2.4滑膜细胞上清液的制备

3.3 滑膜细胞的增殖与凋亡

3.3.1 滑膜细胞的增殖反应

3.3.2 琼脂糖凝胶电泳观察AA大鼠滑膜组织的凋亡

3.3.3 TUNEL检测滑膜细胞凋亡

3.3.4 AnnexinV/PI双染色法检测成纤维滑膜细胞的凋亡率

3.4 IL-1β、TNF-α含量的测定

3.5 实时荧光定量PCR检测滑模细胞中VEGF mRNA、PDGF mRNA、FGF mRNA及TNF-α mRNA的表达

3.5.1 大鼠滑膜组织总RNA的提取

3.5.2 cDNA第一链的合成

3.5.3 引物的设计

3.5.4 实时荧光定量PCR反应

3.6 统计处理

4.结果

4.1rh-End对AA大鼠继发性炎症的治疗作用

4.1.1 rh-End对AA大鼠非致炎侧足肿胀的影响

4.1.2 rh-End对AA大鼠多发性关节指数的影响

4.1.3 rh-End对AA大鼠膝关节病理组织学的影响

4.1.4 透射电镜观察

4.2 大鼠滑膜细胞的形态学观察及鉴定

4.2.1 光镜观察

4.3 rh-End对滑膜细胞增殖能力的影响

4.3.1 rh-End体内用药对滑膜细胞增殖能力的影响

4.3.2 rh-End体外用药对成纤维样滑膜细胞增殖能力的影响

4.4 rh-End诱导成纤维样滑膜细胞凋亡的作用

4.4.1 DNA梯度凝胶电泳观察rh-End诱导滑膜组织凋亡的作用

4.4.2 TUNEL观察rh-End诱导滑膜细胞凋亡的作用

4.4.3 rh-End诱导AA FLS早期凋亡的作用

4.5 rh-End对滑膜细胞分泌功能的影响

4.5.1 rh-End对AA大鼠滑膜细胞培养上清液IL-1β、TNF-α含量的影响

4.5.2 rh-End对AA大鼠滑膜组织TNF-α mRNA基因表达水平的影响

4.6 rh-End对滑膜组织VEGF、PDGF、FGF mRNA表达的影响

4.6.1 SYBR green I 法检测rh-End对滑膜组织PDGF、FGF mRNA表达的影响

4.6.2 Taqman探针检测rh-End对滑膜组织VEGF mRNA表达的影响

5 讨论

6 小结

7 参考文献

个人简历

致谢

综述 VEGF、新生血管与类风湿关节炎