革兰阴性菌中整合子的分布和特征及与耐药性关系的研究

摘要

目的：调查Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子在本地临床分离革兰阴性菌中的检出率及其携带耐药基因的种类和分子结构；了解本地革兰阴性菌通过整合子水平传播耐药现状；分析本地整合子阳性菌菌株间的同源相关性。 方法：根据Genebank上已公布的序列设计引物，运用PCR方法对临床分离革兰阴性菌进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因扩增并进一步使用多重PCR方法对Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因进行扩增。选择部分Ⅰ类整合酶阳性株应用其基因盒可变区和3'保守区引物进行PCR扩增，可变区扩增产物经测序后分析基因序列。设计Ⅱ类整合子上常见耐药基因dfrA1，sat，aadA1引物，偶见的耐药基因ereA引物及基因盒下游序列基因orfX，tnsE，tnsD，tnsC，tnsB，tnsA引物，对Ⅱ类整合酶阳性菌株进行PCR扩增，针对扩增结果使用PCR mapping技术，通过不同基因的上下游引物进行组合，采用降落PCR法进行扩增以检测其常见基因盒间是否还存在其它基因及它们在整合子上的排列顺序，扩增产物经DNA割胶回收纯化后测序，序列经拼接后在NCBI blast上进行基因序列的比对分析。为了解整合子位于细菌的染色体还是接合性质粒上，我们对整合酶阳性菌进行了接合实验，然后对接合子进行Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因的PCR扩增以鉴定整合子是否转移至接合子上；为了进一步确认Ⅰ、Ⅱ类整合子在临床分离菌基因中的定位，我们挑选部分菌株提取质粒，使用标记的intl1和intl2探针对电泳后的质粒进行Southern blotting，经显色来判断整合子是否位于质粒上。用平板稀释法测定质粒接合转移成功的临床分离菌、接合子对15种抗菌药物的MIC值，比较其耐药性差异并分析整合子与细菌耐药性关系。应用ERIC-PCR方法结合接合实验和Southern杂交对整合子的定位分析来研究该地整合子分子流行病学特征。 结果：739株临床分离革兰阴性菌中，Ⅰ类整合酶基因(Intl1)阳性菌株为399株，检出率为54.0％；Ⅱ类整合酶基因(Intl2)阳性菌株为22株，检出率为3.0％，并首次从肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中检测出Ⅱ类整合子；未检出Ⅲ类整合子。本实验所设计的Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因引物能够有效地检测并区分出Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因。在对随机抽取的80株Ⅰ类整合酶基因阳性的菌株进行基因盒可变区及3'保守区PCR扩增，结果有64株扩增出大小长度不等的9种基因盒产物，这些可变区基因盒在所检测的细菌中大致有17种不同的组合模式，77株扩增出3'保守区预期产物。经测序后基因分析，3例Ⅰ类整合子基因盒可变区产物分别为dfrA15，aadA2及aadB、aadA1和cmlA6。403株Ⅰ、Ⅱ类整合子阳性的临床分离菌质粒接合转移成功184株，其中31株接合子中携带整合酶基因。Southern杂交显示Ⅰ类整合子阳性菌中60％(18/30)的菌株其整合子位于质粒上，11株Ⅱ类整合子阳性菌质粒上均未检测出intl2阳性杂交条带。MIC结果显示大多数临床株对常用抗菌药物的MIC值较接合子要高，诸多因素共同参与了细菌对抗菌药物的耐受性，整合酶阳性接合子对庆大霉素的MIC值总体较阴性接合子高。ERIC-PCR显示本研究中二家医院含Ⅰ类整合子的临床分离菌各菌均有一定的相同克隆株流行。 结论 ：(1)Ⅰ类整合子在本地临床分离革兰阴性菌中广泛分布，其整合的基因盒种类多样且在不同菌株中呈多种组合模式；(2)Ⅱ类整合子在本地临床分离革兰阴性菌中检出率较低，其携带的基因盒种类较为固定；(3)本地细菌耐药是由包括整合子在内的多种因素共同参与而形成的；(4)本地二家医院含Ⅰ类整合子的临床分离菌各菌均有一定的相同克隆株流行，应加强对其进行监控，避免其在临床上的大规模流行。

目录

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声明

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

附录

致谢

综述革兰阴性菌中整合子携带超广谱β内酰胺酶的研究进展