声明
英文缩略表
第1章 文献综述
1.1 Ca2+与CDPKs研究进展
1.2 CDPK4研究进展
1.2.1 植物CDPK4
1.2.2 顶复门原虫CDPK4
1.3 蛋白间相互作用的研究方法
1.3.1 免疫共沉淀技术
1.3.2 Pull down技术
1.3.3 双分子荧光互补技术
1.3.4 酵母双杂交技术
1.3.5 其他
1.4 相关蛋白的研究进展
1.4.1 延伸因子1α
1.4.2 真核翻译起始因子5A
1.4.3 吡咯啉-5-羧酸还原酶
1.4.4 14-3-3蛋白
1.5 展望
第2章Co-IP、His pull down与质谱技术筛选EtCDPK4互作蛋白
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验动物与虫株
2.2.2 相关试剂
2.2.3 主要实验仪器
2.2.4 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集纯化及全蛋白提取
2.2.5 His-EtCDPK4可溶性蛋白的收集
2.2.6 从兔抗rEtCDPK4多克隆抗体中提取IgG
2.2.7利用His pull down筛选潜在的EtCDPK4互作蛋白
2.2.8 免疫共沉淀筛选EtCDPK4可能的互作蛋白
2.2.9质谱分析免疫共沉淀和His pull down结果
2.3 实验结果
2.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集与纯化
2.3.2 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊全蛋白的提取
2.3.3 rEtCDPK4蛋白的纯化及兔抗rEtCDPK4抗血清IgG的收集
2.3.4免疫共沉淀和His pull down银染结果
2.3.5 质谱分析结果
2.4 讨论
第3章 四个潜在互作蛋白基因的克隆、原核表达及生物信息学分析
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验动物与虫株
3.2.2 相关试剂
3.2.3 主要实验仪器
3.2.4 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA的提取
3.2.5 孢子化卵囊cDNA第一链的获得
3.2.6 潜在互作蛋白基因扩增
3.2.7 生物信息学分析
3.2.8 构建原核表达载体
3.2.9 诱导表达及纯化重组蛋白
3.3 实验结果
3.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA的提取
3.3.2 基因扩增
3.3.3 原核重组质粒的构建及双酶切鉴定
3.3.4 生物信息学分析
3.3.5 重组蛋白表达与纯化
3.4 讨论
第4章 四个潜在互作蛋白基因的特性与功能初步分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验动物、虫株与细胞
4.2.2 试剂及配制方法
4.2.3 主要实验仪器
4.2.4 柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段虫体的收集与纯化
4.2.5 抗重组蛋白多克隆抗体的制备
4.2.6 重组蛋白反应原性分析
4.2.7 EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR、Et14-3-3转录水平的分析
4.2.8 EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR、Et14-3-3翻译水平的分析
4.2.9 蛋白EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR、Et14-3-3的分布定位
4.2.10 兔抗重组蛋白多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响
4.2.11 统计学分析
4.3 实验结果
4.3.1 重组蛋白反应原性分析
4.3.2 EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR、Et14-3-3转录水平的分析
4.3.3 EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR、Et14-3-3翻译水平的分析
4.3.4 EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR、Et14-3-3免疫荧光定位
4.3.5 体外入侵抑制实验
4.4 讨论
第5章 四个潜在互作蛋白与EtCDPK4互作的验证
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验动物与细胞
5.2.2 相关试剂
5.2.3 主要实验仪器
5.2.4 利用BiFC技术验证潜在与EtCDPK4互作的蛋白
5.2.5GST pull down验证EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4的互作
5.2.6 免疫共沉淀技术验证EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4的互作
5.2.7 EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4共定位
5.3 实验结果
5.3.1 真核重组质粒的构建
5.3.2 BiFC验证潜在与EtCDPK4互作的蛋白
5.3.3 GST pull down验证EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4的互作
5.3.4 免疫共沉淀技术验证EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4的互作
5.3.5 EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4共定位
5.4 讨论
第6章 全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
上海师范大学;
