CpG-ODN对鼠巨噬细胞TLR-9及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响

摘要

背景：支气管哮喘是由淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等多种炎性细胞、炎症介质和细胞因子共同参与的一种气道慢性炎症。免疫反应在哮喘的发病机制中占有重要地位。目前有人研究发现哮喘的发病的重要基础是辅助性T细胞两种亚型Th1和Th2细胞组成的比例和功能失衡。肺泡巨噬细胞可通过吞噬凋亡的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等而有利于哮喘气道炎症的消退，同时也可通过释放多种细胞因子和蛋白酶，参与哮喘免疫炎症反应及气道的修复和重构，为支气管哮喘的重要效应细胞之一。因此，研究巨噬细胞在支气管哮喘发病机制中的作用，调控巨噬细胞功能可能为支气管哮喘治疗提供一个新思路。 CpG-ODN是含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸序列，和细菌DNA一样具有强烈的免疫刺激作用，能激活哺乳动物巨噬细胞、树突状细胞等多种免疫细胞。CpG-ODN还能诱导Th1细胞因子产生，抑制Th2细胞因子的释放，诱导Th1反应，下调Th2反应，并使Th2反应向Th1反应转变，使Th1/Th2免疫反应达到平衡的状态。而调节Th1/Th2平衡对哮喘的治疗具有重要意义。其激活效应细胞途径是通过Toll样受体9 (Toll like-receptor，TLR-9) 介导的。TLR-9在识别CpG-ODN后，通过结构域募集髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)，核因子K B等多条信号途径，启动细胞活化进程，上调主要组织相容性复合物和共刺激分子表达等，进而诱导各种炎性细胞因子的表达。因此研究CpG-ODN与TLR-9相互识别后对巨噬细胞细胞因子的分泌，TLR-9自身表达的影响，对于揭开CpG-ODN调控巨噬细胞功能的分子机制具有重要意义。 目的： (1) 从mRNA 和蛋白水平分析CpG-ODN 刺激鼠巨噬细胞后对鼠巨噬细胞TLR-9的表达。探讨CpG-ODN调控巨噬细胞TLR-9表达的特征。 (2) 检测CpG-ODN刺激前后巨噬细胞上清液中Th1类细胞因子TNF-a、IL-12及Th2类细胞因子IL-6的表达水平，了解CpG-ODN刺激鼠巨噬细胞后对Th1/Th2类细胞因子分泌的影响。探讨CpG-ODN调控巨噬细胞功能及TLR-9表达的分子机制。 方法： (1) 本研究采用体外培养小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞，分别用CpG-ODN，Non-CpG-ODN，CpG-ODN +氯喹和培养基刺激巨噬细胞24小时，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测并比较各组细胞TLR-9mRNA的表达情况，同时用免疫印迹法(Western blotting)进一步验证TLR-9蛋白的表达。 (2) 放免法检测各组巨噬细胞上清液中TNF-a、IL-6的表达水平。酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组巨噬细胞上清液中IL-12的表达水平。 结果： (1) 刺激24小时后，CpG-ODN与CpG-ODN +氯喹组巨噬细胞上清中TLR-9mRNA的表达均显著高于Non-CpG-ODN及对照组(p<0.05)，用Western blotting法进一步证实了CpG-ODN与CpG-ODN +氯喹组巨噬细胞上清中TLR-9蛋白的表达较Non-CpG-ODN及对照组明显增加(p<0.05)。 (2) 巨噬细胞上清液中TNF-a水平CpG-ODN组明显高于其他组，差异有显著性(P<0.05)。而各组巨噬细胞上清液中IL-6，IL-12水平无显著性差异(p>0.05)。 结论： CpG-ODN 刺激鼠巨噬细胞24小时后可引起鼠巨噬细胞TLR-9无论在蛋白水平还是在核酸水平表达均增高，并且能增加巨噬细胞上清液中Th1类细胞因子TNF-Q水平，但不增Th2类细胞因子IL-6及Thl类细胞因子IL-12水平，从而调节Th1/Th2类细胞因子的分泌。CpG-ODN能很好的调控巨噬细胞功能，将为支气管哮喘治疗提供一个新思路。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

1.前言

2.材料和方法

2.1材料

2.1.1细胞和寡脱氧核苷酸：

2.1.2主要试剂

2.1.3主要器材及仪器

2.1.4试验相关试剂的配置

2.1.5防止RNA酶污染的一些措施

2.2实验方法

2.2.1细胞培养

2.2.2逆转录多聚酶链反应(PT-PCR)法检测TLP-9mRNA含量

2.2.3 Western Blotting分析

2.2.4 培养上清中TNF-α，IL-6、IL-12的测定

2.3统计学处理

3.结果

3.1 CpG-ODN对TLR-9 mRNA的影响

3.2 Western blotting分析TLR-9蛋白的表达

3.3巨噬细胞培养上清TNF-α，IL-6、IL-12的检测

4.讨论

5.结论

6.进一步设想

6.1本实验不足之处

6.2进一步设想

参考文献

附录

致谢

综述 CpG DNA的免疫作用及调节Th1/Th2细胞因子的意义