背景：精子发生是一个连续的细胞分裂分化过程，包括精原细胞分裂增殖、精母细胞减数分裂和精子细胞变态过程三个主要阶段，并最终产生成熟的精子。减数分裂的完成依赖于许多精细的亚细胞结构并伴有一系列复杂的重要事件，包括同源染色体的配对、联会、重组交换和交叉的形成。对减数分裂这些重要事件尤其是联会复合体的研究分析将有助于理解精子发生失败的原因，从而揭示男性不育内在的病因。近年来，学者们将免疫荧光染色技术应用于细胞遗传学的方法使对减数分裂重组位点进行准确的定位分析成为可能。联会复合体蛋白SCP1和SCP3的抗体让我们能够观察到AE和TE从细线期早期的形成一直到双线期末期的解聚。MLH1的抗体能将重组位点在SC上定位，着丝粒可被CREST抗着丝粒血清标记。因此，通过免疫荧光染色可以清晰的显示SC并准确标记遗传重组位点，从而“直视”减数分裂的联会与重组过程。该技术已分别在对小鼠和人的精母细胞和卵母细胞实验中被证明有效。随着社会的发展，不孕不育症的发病率呈持续增高趋势，在男性不育症中，尽管其中部分严重少弱畸精子症和无精子症患者可通过卵细胞胞浆内单精子显微注射(ICSI)等方法获得自己的生物学后代，但这些助孕技术绕过受精过程中对异常精子的自然淘汰的过程，有传递遗传缺陷给后代的危险。因此深入了解精子发生障碍的细胞生物学基础对阐明无精子症患者的病因具有重大的意义。 目的：本研究通过精母细胞免疫荧光染色初步探讨无精子症患者精母细胞减数分裂过程中联会与遗传重组的情况。 方法：对7例对照人群和7例无精子症患者，包括2例梗阻性无精子症（OA）和5例非梗阻性无精子症（NOA），睾丸组织精母细胞进行免疫荧光染色。联会复合体侧向成分SCP3抗体标记联会复合体，MLH1(DNA修复蛋白) 抗体定位遗传重组位点。根据SCP3的形态可以鉴别减数分裂I前期细线期、偶线期、粗线期及其后期的精母细胞，从而分析减数分裂的进程，通过对粗线期精母细胞每条染色体MLH1位点频率的分析以了解减数分裂I前期遗传重组情况，对染色体联会过程中未完全联会的SCP3的分析可以进一步了解减数分裂过程中异常联会的情况。计数资料采用χ2 检验，计量资料采用方差分析(ANOVA)，p<0.05，具有统计学意义。 结果：⑴在7例对照人群中共分析了2346个精母细胞，细线期、偶线期及粗线期细胞比例分别为：14.0％，4.8％和 81.4％。7例无精子症患者中共分析2932个精母细胞，2例OA患者偶线期细胞比例分别为：15％、23％，较对照组显著增加，4例NOA患者偶线期细胞比例较对照组显著增加（19％，10％，13％，28％ vs 4.8％）。提示在无精子症患者的精母细胞中偶线期细胞比例增加，减数分裂进程发生延迟，而且这种现象既可以发生在非梗阻性无精子症患者中，也可以发生在梗阻性无精子症患者中。⑵分析了7例对照组1867个粗线期精母细胞，平均每个粗线期精母细胞MLH1位点数为49.54±4.2（34-65），対7例无精子症患者，共详细分析了354个粗线期精母细胞，每个细胞MLH1位点平均数目分别为44.1±4.9、48.7±6.6、48.4±6.4、49.7±5.0、13.2±13.5、39.2±14.8和45.1±7.1。1例OA患者的平均每个细胞MLH1位点数较对照组减少（44.1±4.9 vs 49.54±4.2，p<0.05），另2例NOA患者平均每个细胞MLH1位点数较对照组显著减少（13.2±13.5，39.2±14.8 vs 49.54±4.2，p<0.01）。⑶对照组中平均每人常染色体上含有0、1、2、3、4个MLH1数目的染色体均数分别为：0.1、3.47、11.49、5.54和1.29。2例OA和4例NOA患者中常染色体上无MLH1位点的染色体数目较对照组显著增加，在患者6中发现整个细胞中仅含有1个MLH1信号的细胞，常染色体上含有2、3、4个MLH1信号的染色体数目较对照组显著减少。7例对照人群分析的粗线期精母细胞中，含有至少一条染色体臂上无MLH1的细胞的比例为4.3％（0－11％），2例OA患者分析的粗线期精母细胞中，含有至少一条染色体臂上无MLH1的细胞的比例较对照组增高（13％，17％ vs 4.3％，p<0.01），4例NOA患者这种细胞的比例较对照组增高（25％，36％，28％，18％ vs 4.3％，p<0.01）。2例OA患者X、Y染色体上有MLH1位点的细胞比例较对照组降低（62％ vs 75.29％，p<0.05；60％ vs 75.29％，p<0.01），3例NOA患者 X、Y染色体上有MLH1位点的细胞比例较对照组显著降低（56％，45％，20％ vs 75.29％，p<0.01）。⑷7例对照人群中，含有gap和split的粗线期精母细胞比例分别为13.9％（5％－21％）、2.3％（0－9％）。2例OA患者中含有gap和split的细胞比例与对照组无统计学差异；2例NOA患者含有gap的细胞比例较对照组显著增高（53％，41％ vs 13.9％，p<0.01），2例NOA患者含有split的细胞比例较对照组显著增高（24％，19％ vs 2.3％，p<0.01）。 结论：通过免疫荧光染色可以鉴别无精子症患者减数分裂I前期精母细胞的类别，从而了解减数分裂的进程，与正常对照组相比，无精子症患者减数分裂过程出现延迟；在无精子症患者中,粗线期精母细胞重组频率有减少的现象发生，常染色体上无MLH1位点的染色体数目增加和含有至少一条染色体臂上无MLH1位点的细胞比例升高，性染色体上有MLH1位点的细胞比例降低；非梗阻性无精子症患者粗线期精母细胞中，含有gap和split细胞的比例升高；这些减数分裂过程的延迟和联会与重组事件的异常可能与无精子症的发生有关。
展开▼
