维甲酸受体β2表达下调导致环氧合酶2表达上调在食管癌发生中的作用

摘要

背景：食管癌发病率较高,预后较差,严重影响人类的健康。其地区差异性较为明显,但发病的详细机制尚不十分明确。国内外大量文献报道吸烟、饮酒、环境污染物(如BPDE,4-NQO等)等危险因素均可引起肿瘤相关启动基因(如EGFR,p-ERK1/2,COX-2等)表达上调或抑癌基因(如p53,RAR-β2等)表达下调,从而导致食管癌的发生,但关于RAR-β2与EGFR,p-ERK1/2,COX-2等在食管癌发生发展过程中作用的相关文献报道较少。本课题组前期研究结果表明食管癌细胞中RAR-β2基因表达下调可以引起COX-2基因表达上调,进一步导致EGFR,p-ERK1/2及AP-1等基因的表达升高,但这些基因之间相互作用的分子生物学机制尚待进一步研究。
　　目的：研究食管癌组织或细胞中RRIG1,RAR-β2,EGFR,p-ERK1/2及COX-2等基因mRNA或蛋白的表达情况,探讨这些基因和蛋白的表达异常在食管癌发生发展过程中的作用及相关临床病理意义。
　　方法：1.利用免疫组织化学染色技术研究EGFR, p-ERK1/2及COX-2等蛋白在正常食管黏膜组织、食管上皮内瘤变组织及ESCC组织中的表达情况,分析其临床病理意义;利用qRT-PCR技术检测ESCC组织及正常食管黏膜组织中RRIG1 mRNA的表达水平;采用原位杂交技术研究食管癌组织中RAR-β2与COX-2 mRNA的表达情况,分析其相互联系。
　　2.利用siRNA技术抑制食管癌TE-8,SKGT-4及HCE-4细胞中COX-2的表达,比较COX-2低表达组和对照组细胞的生长差别;用4-NQO处理食管癌TE-3,TE-8细胞及转染SV-40后永生的食管上皮 HET-1A细胞,提取细胞mRNA和蛋白,利用qRT-PCR及Western blotting比较处理组和对照组细胞中RAR-β2,p-ERK1/2,COX-2,t-ERK1/2及AP-1等基因mRNA和蛋白的表达差别,阐述其相互关系。
　　3.利用化学物质4-NQO诱导C57BL6小鼠食管癌的发生,采用免疫组织化学染色检测处理组及对照组小鼠食管组织中p-ERK1/2及COX-2蛋白表达差别;利用qRT-PCR技术检测两组标本中RAR-β2及COX-2 mRNA的表达变化。此外,利用甲基化特异性PCR技术检测小鼠ESCC组织RAR-β2基因是否发生甲基化修饰。
　　结果：1.在人体正常食管黏膜组织、食管上皮内瘤变组织及ESCC组织中,EFGR蛋白的阳性率分别为7.2％,38.1%及41.1%,食管上皮内瘤变组织和ESCC组织中的阳性率均明显高于正常食管黏膜组织,其差别具有统计学意义(χ2=12.398,P=0.002;χ2=23.044,P=0.000);p-ERK1/2的阳性率分别为5.8%,14.3%及18.9%,其中ESCC组织 p-ERK1/2的阳性率显著高于正常食管粘膜组织,差别具有统计学意义(χ2=5.84,P=0.018);COX-2蛋白的阳性率分别为20.3%,28.6%及42.2%,ESCC组织中COX-2阳性率明显高于正常食管粘膜组织,其差别具有统计学意义(χ2=8.536,P=0.004)。低分化ESCC组织中EGFR, p-ERK1/2及COX-2蛋白的表达明显高于中分化及高分化ESCC组织(分别为χ2=12.022,P=0.001;χ2=0.394,P=0.752及χ2=9.274,P=0.003)。p-ERK1/2蛋白的表达与ESCC患者热烫饮食(T>70℃)、术后5年生存率及肿瘤组织的浸润深度明显相关(分别为χ2=6.795,P=0.016;χ2=5.394,P=0.030及χ2=7.727,P=0.049)。正常食管黏膜组织中RRIG1基因mRNA的表达是ESCC组织的2.19倍(Z=-1.988,P=0.049)。食管癌组织中RAR-β2与COX-2表达呈负相关(McNammar检验,P=0.001)。
　　2.细胞实验结果显示,与对照组相比,抑制COX-2基因表达后食管癌细胞的生长受到抑制;4-NQO可以引起食管癌TE-3细胞及食管上皮HET-1A细胞中RAR-β2 mRNA表达下调,并且上调COX-2 mRNA的表达。此外,4-NQO处理食管癌细胞及HET-1A细胞引起p-ERK1/2,COX-2及AP-1蛋白表达均上调。
　　3.动物实验结果显示,4-NQO使ESCC组织中RAR-β2基因启动子CpG岛的DNA序列发生甲基化修饰,降低RAR-β2表达水平,导致COX-2表达上调。与对照组相比,4-NQO处理组小鼠食管组织中COX-2及p-ERK1/2蛋白表达均上调。
　　结论：EGFR,p-ERK1/2及COX-2等基因表达与食管癌的发生、发展具有正相关关系,而RAR-β2及RRIG-1基因表达与食管癌的发生、发展具有负相关关系。4-NQO可以引起RAR-β2基因启动子发生甲基化修饰,降低RAR-β2基因mRNA的表达水平;同时,4-NQO可上调食管癌细胞系和动物食管癌组织中p-ERK1/2及COX-2等蛋白的表达。RAR-β2表达下调可以引起COX-2表达升高。

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1引言

2 材料与方法

2.1 人体肿瘤组织研究

2.1.1 标本收集及相关临床病理资料

2.1.2 组织芯片的制备

2.1.3 免疫组织化学染色

2.1.4 原位杂交

2.1.5 免疫染色结果的判断及评分

2.1.6 实时荧光定量RT-PCR

2.2 体外实验

2.2.1 细胞系及细胞培养

2.2.2 抑制食管癌细胞中COX-2 基因表达

2.2.4 培养细胞的RNA提取及qRT-PCR检测

2.2.5 细胞中蛋白的提取及Western blotting检测

2.3 体内动物实验

2.3.1 实验小鼠建模

2.3.2 免疫组织化学染色

2.3.3 福尔马林固定石蜡包埋组织的qRT-PCR检测

2.3.4 甲基化特异性PCR

2.3.5 PCR产物克隆及DNA测序

2.4 统计分析

3 结果

3.1 人体肿瘤组织研究结果

3.1.1 EGFR, p-ERK1/2及COX-2蛋白在正常食管黏膜、食管上皮内瘤变及ESCC组织中的表达

3.1.2 ESCC组织中EGFR, p-ERK1/2及COX-2的表达与患者临床病理特征的关系

3.1.3 EGFR, p-ERK1/2及COX-2蛋白的表达与ESCC患者术后总体生存时间的关系

3.1.4 EC组织中RAR-β2表达下调与COX-2表达上调间的关系

3.1.5 RRIG1基因在ESCC组织及正常食管黏膜组织中的表达

3.2 体外细胞实验

3.2.1 COX-2基因的表达与EC细胞的生长的关系

3.2.2 4-NQO诱导EC细胞中COX-2基因表达上调

3.2.3 HET-1A，TE-3及TE-8细胞中t-ERK1/2, p-ERK1/2, AP-1及COX-2蛋白的表达

3.3 动物实验

3.3.1 4-NQO诱导C57BL6实验小鼠肿瘤发生模型的构建

3.3.2 C57BL6小鼠食管组织中p-ERK1/2及COX-2蛋白的表达

3.3.4 C57BL6小鼠食管组织中RAR-β2及COX-2基因mRNA的表达

3.3.5 C57BL6小鼠ESCC组织中RAR-β2基因启动子CpG岛的甲基化

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述