合肥地区新生儿人巨细胞病毒先天性感染的基因型分析

摘要

目的：本研究采集正常产妇抗凝脐带血样本进行人巨细胞病毒(human cytomegalo virus,HCMV)分离和鉴定,分析探讨合肥地区HCMV先天性感染的分子流行病学特征和病毒糖蛋白B基因型别。为进一步研究其致病性、免疫性以及研制HCMV亚单位疫苗提供依据。
　　方法：从临床采集正常顺产妇(年龄在19~38岁)的脐带血样本160例,按实验设计分别作如下处理:(1)HCMV先天性感染的实验室检测:HCMV病毒分离,将样本接种至人胚成纤维细胞(HF)上,观察CPE(Cyto pathic effect,CPE),对分离得到的病毒株应用间接免疫荧光法(indirectimmuno fluorescence assay,IFA)鉴定后,体外培养病毒并提取DNA采用PCR检测HCMVIE和UL83基因。同时应用pp65抗原血症的方法直接检测脐带血白细胞样本中HCMVpp65抗原。记录分析结果,确定合肥地区新生儿HCMV先天性感染率。(2)HCMV先天性感染临床分离株的基因型分析:通过限制性片段长度多态性分析(RFLP)对RsaI和HinfI酶切位点的突变情况进行分析;对PCR产物进行纯化后测序,并且使用MEGA4.0软件用邻接法(neighbor joining)构建进化树。(3)建立随访档案,HCMV先天性感染临床资料的收集与分析:对HCMV先天性感染的新生儿建立随访档案,对其进行回顾性调查以及远期临床追踪调查,特别是基因变异较大的新生儿应该作为首选随访对象。
　　结果：(1)HCMV先天性感染的实验室检测结果:从临床采集的160份样本中经病毒分离鉴定后得到阳性样本40份,病毒分离阳性率为25.0％,pp65抗原血症的方法得到阳性样本39份,阳性率为24.4%。分析结果后确定合肥地区HCMV先天性感染率约为25.0%。(2)HCMV先天性感染临床分离株的基因型分析:应用RFLP分析,结果显示:40例阳性标本均为gB-2型,未见其他型别。同时发现该基因型已有变异,其中HeFei-01,HeFei-03和HeFei-21标本分别有24(7.95%)个,28个(9.27%)和30个突变位点(9.93%)。MEGA4.0软件绘制的系统发育树显示:所有的临床样本与HCMVAD169株在同一个侧枝上,但是HeFei-01,HeFei-03和HeFei-21三株临床样本变异很大,与HCMVgB-2型的进化距离较远。(3)建立随访档案,HCMV先天性感染临床资料的收集与分析:HeFei-21分离株的新生儿出生时出现早产,胎儿宫内发育迟缓,出生时低体质量,出生时体重仅2.2千克,符合宫内发育迟缓的诊断标准。
　　结论：(1)对160例正常顺产妇所娩新生儿的抗凝脐带血进行HCMV较系统的实验室检测和鉴定,初步确定合肥地区正常顺产妇所娩新生儿HCMV先天性感染率的基线数据约为25.0%;(2)对于鉴定为HCMV先天性感染的样本分别命名为HeFei-01~HeFei-40。HCMV先天性感染的gB基因序列比对及进化树分析表明:合肥地区正常顺产妇所娩新生儿HCMV先天性感染的基因型别均为gB-2型,未见其他型别。(3)同时发现HeFei-01,HeFei-03和HeFei-21三例临床标本分离病毒株基因变异很大,变异最大的HeFei-21分离株的新生儿出生时体重仅2.2千克。(4)今后开展临床随访调查时,应该将基因变异较大的新生儿作为首选的随访对象。

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1. 前言

1.1 HCMV先天性感染的危害性

1.2 HCMV的主要基因及其结构

1.3 HCMV感染与基因分型

2． 材料和方法

2.1 材料

2.2 研究方法

3 结果

3.1 样本病毒分离与鉴定

3.2 HCMV先天性感染的基因分型检测结果

3.3 HCMV先天性感染临床资料的分析

3.3 临床随访调查

4讨论

4.1 HCMV不同疾病的型别分析

4.2 HCMV先天性感染与型别分析

4.3 人巨细胞病毒与先天性感染的型别分析

4.2 课题设计的优缺点

5. 结论

6. 研究展望

参考文献

附录一：

附 录 二：简历

致谢

综述