Toll样受体表达和树突状细胞表型、功能在实验性结肠炎中的变化及益生菌的作用

摘要

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的病因和发病机制未明，严重危害健康，但缺乏特效治疗方法，因此IBD的机制和治疗的研究成为目前医学研究的热点。研究显示肠道菌丛在IBD的发病中起关键作用，使用益生菌治疗IBD 有一定的疗效，但其机制尚不清楚。2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)引起的结肠炎为乙醇造成结肠粘膜损伤后暴露的结肠蛋白与TNBS结合后形成自身抗原，导致免疫异常引起炎症，其发病机制和临床病理改变与人类IBD相似，其作为IBD的动物模型被国内外广泛用于IBD的实验研究。本课题通过建立TNBS诱导的大鼠IBD模型，观察和探讨大鼠肠道部分菌群、内毒素水平、结肠TLR2、TLR4和NF-κ Bp65的表达及肠系膜淋巴结树突状细胞表型和功能的变化及其意义，并分析和探讨双歧三联活菌的作用。 第一部分：实验性结肠炎大鼠结肠菌群和血浆内毒素水平的变化及双歧三联活菌的作用。 目的: 建立TNSS诱导的大鼠结肠炎模型，观察和分析其结肠炎症、菌群和血浆内毒素水平的变化及双歧三联活菌的作用，并与美沙拉嗪的作用进行比较。 方法： 雄性Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组(Nc组)、阳性对照组(UC组)、双歧三联活菌治疗组(Blflco,Bc组)和美沙拉嗪对照组(MC组)，每组10只，采用TNBS(100mg/kg)乙醇溶液一次性灌肠法建立大鼠结肠炎模型；双歧三联活菌(2.2×10<'9>CFU/只)和美沙拉嗪(200mg/只)治疗4周，邻甲联苯胺法检测大便隐血情况。实验结束时处死大鼠留取结肠及心脏采血分离血浆；旺染色观察各组大鼠结肠炎症情况，并盲法行炎症评分，对结肠内的部分细菌进行培养；鲎试验测定大鼠血浆内毒素水平，分析其变化，并观察该益生菌对大鼠结肠炎症、细菌和血浆内毒素水平的影响。 结论： TNBS诱导的结肠炎大鼠，其结肠粘膜炎症明显，存在结肠菌群紊乱，双歧杆菌和乳酸杆菌显著减少，同时伴血浆内毒素水平明显增高。双歧三联活菌可减轻大鼠的结肠炎症，改善菌群紊乱，降低内毒素水平，但其减轻炎症的效果不如美沙拉嗪。 第二部分：实验性结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中树突状细胞表型和功能的变化及双歧三联活菌的作用。 目的: 观察和分析结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中树突状细胞(Dendritic Cells，DCs) 表型及刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的变化；并探讨双歧三联活菌对结肠炎大鼠肠道：DCs成熟与功能的影响。 方法： 实验动物、分组、模型的建立及给药见第一部分(无MC组)，动物处死时取出全部肠系膜淋巴结。免疫组化染色法检测肠系膜淋巴结DCs表面特征性标志OX-62和成熟标志CD83的表达；密度梯度离心法和淘洗法分离纯化DCs；流式细胞仪分析DCs表面分子MHC-Ⅱ及共刺激分子CD86的表达；同种混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结论： 结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中成熟的DCs明显增多，表面分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86表达明显上调，刺激T淋巴细胞增殖的能力增强，提示该结肠炎大鼠存在DCs活化增多，功能增强。双歧三联活菌可明显减少其肠系膜淋巴结中成熟的DCs，使DCs表面的共刺激分子表达下调，提示该益生菌可减少肠道DCs成熟与活化，降低其刺激T淋巴细胞增殖的能力，间接减少肠系膜淋巴结T淋巴细胞的活化，从而减轻炎症。 第三部分：实验性结肠炎大鼠结肠TLR2、TLR4和NF-κ Bp65的表达及双歧三联活菌的作用。 目的: 观察和分析Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)、Toll样受体4Toll-like.receptot 4，TLR4) 及核因子 K Bp65(Nuclear factor-kappap65，NF-κ Bp65)蛋白及mRNA在结肠炎大鼠结肠中的表达，并观察双歧三联活菌干预后的变化，探讨双歧三联活菌对该信号通路的影响。 方法： 实验动物、分组、模型的建立及给药同第一部分(无MC组)，动物处死时留取全部结肠(包括盲肠)。免疫印记法(Western Blotting)和实时荧光定量PCR分别检测大鼠结肠 TLR2、TLR4、NF-κ Bp65蛋白及mRNA的表达。 结论： TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠上模式识别受体TLR2、TLR4和转录因子NF-κ Bp65表达明显增高，表明与抗原接触机会增多和核转录增加；双歧三联活菌可明显降低上述模式识别受体和NF-κBp65的表达，提示该益生菌可降低肠腔抗原的摄取，减少抗原的递呈及核转录产物的生成。 第四部分：实验性结肠炎大鼠粘膜与系统水平细胞因子的变化及双歧三联活菌的作用。 目的: 观察和分析结肠炎大鼠粘膜和系统水平细胞因子的情况及双歧三联活菌对细胞因子产生的影响。 方法： 实验动物、分组、模型的建立及给药见第一部分(无MC组)。实验结束时无菌取脾及小肠派伊尔氏淋巴滤泡(Peyers’patches，PP)，分离脾细胞和PP免疫细胞，与大肠杆菌标准株共同培养72h后，酶免疫分析法(EIA)检测上清液中 TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-10和TGF-β水平。 结论： TNBS诱导的结肠炎大鼠PP细胞和脾细胞对革兰氏阴性大肠杆菌标准株的反应增强，促炎症性细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-12产生增加，抗炎症性细胞因子IL-10产生减少，粘膜水平和系统水平均存在促炎症性细胞因子和抗炎症性细胞因子间的平衡失调。双歧三联活菌可降低粘膜水平和系统水平的促炎症性细胞因子的产生，增加抗炎症性细胞因子的产生，减轻两类细胞因子间的失平衡。

目录

论文说明：英文缩写

声明

前言

第一部分实验性结肠炎大鼠结肠菌群和血浆内毒素水平的变化及双歧三联活菌的作用

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分实验性结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中DCs表型和功能的变化及双歧三联活菌的作用

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分实验性结肠炎大鼠结肠TLR2、TLR4和NF-κ Bp65的表达及双歧三联活菌的作用

材料和方法

结果

讨论

小结

第四部分实验性结肠炎大鼠粘膜和系统水平细胞因子的变化及双歧三联活菌的作用

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

彩图

参考文献

综述一： 树突状细胞与肠道粘膜免疫

综述二：Toll样受体，核因子－κB与炎症性肠病

在读期间撰写和发表的论文及获奖情况

致谢