组织间隙液中肝细胞癌诊断候选标志物的发现

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种高死亡率的常见恶性肿瘤,每年约有650,000人死于HCC,且其发病率有增高的趋势。在我国,绝大多数HCC是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)慢性感染引起的,甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)曾是用于HCC检测的唯一标记物,但AFP的敏感性和特异性尚不理想,远远不能满足HCC临床诊断的需求,因此亟需发现更多更灵敏的生物标志物。
　　蛋白质组学作为全面分析蛋白质表达变化的有力工具,已被广泛应用到多种疾病的研究中。就肝细胞癌而言,运用蛋白质组学技术可以整体、动态、定量地研究肝细胞癌发展过程中蛋白质种类及其含量的改变,从而阐述HCC的发病机制和发现与癌症进程相关的蛋白质,从而实现肝癌诊治方面的突破。
　　肝组织间隙液(Tissue interstitial fluid,TIF)是介于体液(如血液)和细胞内液之间的液体媒介,肝实质细胞通过TIF与循环外液间进行着物质和信息交换。同时,肿瘤细胞来源的分泌蛋白或由于坏死破碎而释放的细胞蛋白也会存在于TIF这个微环境中,这些蛋白会成为非常有潜力的肿瘤标志物。因此,对TIF进行研究,不仅会对肿瘤的发生机制提供有益的信息,还将为肿瘤标志物的寻找提供新的思路。而且相对于血浆,TIF中的疾病特异性蛋白不会被明显稀释,也不会被来自其他组织或者器官的非相关蛋白干扰,低丰度局部蛋白相对血浆而言更加富集。
　　本研究在思路上的创新点是利用蛋白质组分析,从 TIF中寻找肝细胞癌的血清诊断标志物,进行差异蛋白质组分析。实验室前期建立了小鼠肝脏及正常成人肝脏 TIF的提取方法,并对细胞器蛋白污染进行了评价。在此基础上,我们选取了6例配对的临床HBV-HCC的TIF样本采用双向荧光差异凝胶电泳(Differential in-gel electrophoresis,2D DIGE)技术(本论文中鉴定部分主要呈现DIGE数据)、iTRAQ相对定量(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)技术、质谱差减技术来分析肿瘤-癌旁成对样品间的差异。结合三种定量方法,共鉴定到1276个差异蛋白。其中2D DIGE技术共鉴定到113个差异蛋白,包括上调蛋白41个,下调蛋白72个。
　　对DIGE技术鉴定的差异蛋白进行亚细胞定位分析,结果表明:TIF中存在较多的胞浆、胞核和质膜蛋白,可能与胞吐、胞吞、分泌、细胞膜囊泡脱落过程以及细胞降解产物的释放有关。对差异蛋白进行 GO分析得知:这些蛋白主要参与细胞通讯、识别、粘附、信号转导、蛋白转运等过程,说明这些功能类别的蛋白质可能参与了HCC的发生发展过程。在所鉴定到的蛋白中,只有22个蛋白是血浆蛋白(占19.5％),表明与血浆相比,TIF中存在更高浓度的组织局部蛋白。
　　本研究发现并验证了系列新的HCC诊断候选标志物,在文献中并没有它们与HCC相关的报道。其中氯离子通道蛋白(Chloride intracellular channel protein1,CLIC1)、酮糖转移酶(Transketolase,TKT)、原肌球蛋白3(Tropomyosin alpha-3 chain,TPM3)等3个上调蛋白和烟酰胺核苷焦磷酸化酶(Nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase,QPRT)等下调蛋白在TIF样本中的表达量得到了Western Blot(WB)验证。并且通过WB结果首次证明了TIF相对组织和血浆在肿瘤标志物发现方面的优势。
　　在肿瘤标志物的研究过程中,血清/血浆有很好的可操作性及临床应用价值,故采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),选用四组临床血清样本(正常组、慢性乙型肝炎感染组、肝硬化患者组和HCC组,每组20例样本),对iTRAQ技术发现的两种肿瘤上调蛋白S100A9蛋白和维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein,VDBP)进行了验证,结果表明:候选蛋白VDBP和S100A9的血清浓度在肝硬化组和HCC组间有显著差异,经ROC曲线分析,曲线下面积(aera of under curse,AUC)分别等于0.955和0.898,值得在更大规模的临床血清样本中进一步验证。

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引言

第一部分 肝癌组织间隙液差异蛋白质组分析

1 材料

1.1 HCC病人临床组织样本及血液样本

1.2 试剂

1.3 主要仪器

1.4 常用试剂的配制

2 方法

2.1 TIF的提取方法

2.2 2D DIGE实验

2.3 质谱分析和数据库搜索

2.4 差异蛋白分析

2.5 候选蛋白选取原则的建立

2.6 Western Blot确认候选蛋白的表达量变化

3 实验结果

3.1 差异点的软件分析和质谱鉴定

3.2 差异蛋白的功能分析

3.3 候选蛋白的Western Blot验证

4 讨 论

5小 结

第二部分 候选蛋白的初步临床验证

1 材料

2 ELISA实验方法

3 实验结果

3.1 ELISA分析各组血清中S100A9蛋白的含量

3.2 ELISA分析各组血清中VDBP蛋白的含量

3.3 受试者工作特征曲线分析（Receiver Operator Characteristic Curve，ROC）

5 讨 论

4 小 结

全文结论

参考文献

个人简历

硕士生期间的研究成果

致谢

附 表1 SDS PAGE胶的配制成分与方法