莪术二酮抗血栓和抗血小板聚集作用研究

摘要

随着社会的发展和人们生活水平的提高,心血管疾病已成为死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织的统计,每年死于心血管疾病的人占世界总死亡人数的1/3。研究表明,大多数心血管疾病都与血栓形成、血栓栓塞密切相关。因此,开发天然、高效、毒副作用小的抗血栓药物成为当今医药领域研究的重点。
　　莪术是姜科植物蓬莪术(Curcuma phaeocaulis Valeton)、广西莪术(Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang)和温郁金(Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C. Ling)的干燥根茎,具有行气破血、消积止痛的功效。常被用于血郁引起的血瘀并发症和月经期的调经治疗。作为传统的抗血郁药物,目前还没有研究寻找到主要活性成分,因此有必要对其单体进行活性研究,并联系其抗血栓活性。前期通过初步活性筛选,发现莪术二酮可能是其抗血郁作用的主要活性成分之一。于是本课题在此基础上通过具体实验研究其抗血栓活性及其机制探讨,为莪术的开发应用提供实验依据。本研究的实验内容如下:
　　1.莪术二酮分离制备
　　莪术油采用硅胶柱色谱方法,石油醚和乙酸乙酯不同比例洗脱,得到四种成分,HPLC测定其含量达到98％以上,经过结构鉴定分别为莪术二酮(curdione)、吉马酮(germacrone)、莪术醇(curcumol)和异莪术醇(isocurcumol),且莪术二酮得率为11%。同时实验结果证实此方法是一种相对简单、高效的分离方法。
　　2.莪术二酮抗血栓作用的实验研究
　　实验旨在考察莪术二酮抗血栓药理作用及其作用途径。应用角叉菜胶致小鼠尾血栓形成,观察血栓形成相对平均长度(%);通过毛细管法测定小鼠凝血时间(CT);应用全自动血凝仪测定大鼠凝血酶原时间(PT)、部分活化凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT);放免法测定大鼠血浆中TXB2、6-keto-PGF1α含量;酶联免疫法(ELISA)测定NO、P-selectin含量;以肾上腺素与冰水刺激为致淤因素复制大鼠血瘀证动物模型,观察莪术二酮对血瘀证模型全血不同切变率下的黏度变化及血浆黏度变化。结果显示,在小鼠尾血栓形成实验中,莪术二酮能明显地抑制尾血栓形成;莪术二酮中、高剂量能显著延长小鼠CT,从而影响小鼠凝血功能;能延长大鼠APTT和TT,但对PT影响不明显;能提高血浆NO含量;莪术二酮低、中剂量降低P-selectin水平和TXB2/6-keto-PGF1α比例;莪术二酮可减低血瘀模型大鼠全血黏度和血浆黏度,改善血液循环(p<0.05)。结果提示莪术二酮具有抗血栓形成作用和抗凝血作用;其抗凝血作用是通过内源性凝血途径发挥作用;而其抗血栓作用可能与改善血液流变学和抑制血小板功能有关。
　　3.莪术二酮抗血小板聚集作用研究
　　实验旨在研究莪术二酮抗血小板聚集作用。采用Born比浊法检测莪术二酮对不同诱导剂(PAF、ADP、凝血酶和AA)诱导人血小板聚集的影响;流式细胞术检测PAF活化P-selectin表达;用荧光双波长分光光度计比值法检测莪术二酮对静息血小板和激活后血小板的[Ca2+]i;酶联免疫法(ELISA)测定血小板胞内cAMP;应用血小板聚集仪测定不同通路阻滞剂(PD98059、SB203580、SP600125)对PAF活化血小板功能的影响。结果显示莪术二酮能抑制PAF和凝血酶诱导人血小板聚集,且对PAF诱导作用更明显,而对ADP和AA作用不明显;莪术二酮能降低PAF活化血小板内[Ca2+]i含量;能升高血小板内cAMP水平;PD98059、SB203580和SP600125能抑制PAF诱导人血小板聚集。结果提示莪术二酮能抑制人血小板聚集,特别是对PAF诱导血小板聚集作用最明显,其作用机制与其抑制血小板[Ca2+]i的释放、胞外Ca2+内流和升高cAMP水平有关。另外MAPK信号通路参与了PAF诱导人血小板聚集过程,但是莪术二酮是否作用于MAPK信号通路还有待于进一步研究。

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前 言

第一部分莪术二酮抗血栓作用的实验研究

1. 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验药品与试剂

1.3 主要仪器与设备

2. 实验方法

2.1 莪术二酮的制备性分离、纯化

2.2 尾血栓形成实验

2.3 莪术二酮对凝血系统的影响

2.4 P-selectin含量的测定

2.5 NO含量测定

2.6 TXB2、6-keto-PGF1α 含量的测定

2.7 血瘀模型血液流变学的测定

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 莪术二酮的确证

3.2 莪术二酮对小鼠尾血栓形成的影响

3.3 莪术二酮抗凝血作用实验

3.4 莪术二酮对大鼠血清NO、血浆P-selectin水平的影响

3.5 莪术二酮对大鼠TXB2、6-keto-PGF1α的影响

3.6 莪术二酮对血液流变学的影响

4. 讨论

第二部分莪术二酮抗血小板聚集作用研究

1. 实验材料

1.1 实验药品与试剂

1.2 主要仪器与设备

2. 实验方法

2.1 富集血小板血浆 (PRP) 和贫集血小板血浆 (PPP) 的制备

2.2 血小板聚集功能测定

2.3 流式细胞术检测 CD62p 表达

2.4 洗涤血小板悬液的制备

2.5 负载血小板悬液 (Fura-2 platelet supension, FPS) 的制备

2.6 血小板胞内[Ca2+]i 测定

2.7 cAMP 的测定

2.8 MAPK 阻断剂对血小板聚集功能测定

2.9 统计学处理

3. 结果

3.1 静息和活化态血小板的形态学

3.2 莪术二酮对人血小板聚集的影响

3.3 莪术二酮抑制血小板P-selectin表达

3.4 莪术二酮抑制血小板胞内 [Ca2+]i动员

3.5 莪术二酮增加胞内 cAMP 水平

3.6 MAPK阻断剂能抑制PAF诱导人血小板聚集

4. 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢

综述