自噬受体Optineurin分子机制的初步研究

摘要

目的:本文旨在通过GSTPull-down、免疫荧光、酵母双杂交等技术初步研究自噬受体Optineurin在参与细胞凋亡调控、NF-KB信号通路,抗病毒和细菌感染的作用机制。为进一步研究OPTN在青光眼、神经退行性疾病中的作用机制奠定了研究基础。
　　方法:分别构建以下克隆:pET28a-OPTN-HA、pGEX-4T-1-LC3、重组载体pCDGFP-OPTN真核表达载体,将酶切鉴定正确的重组质粒送公司测序;利用大肠杆菌BL21菌株表达并体外纯化GST-LC3融合蛋白和OPTN蛋白,通过GSTPull-down技术检测OPTN蛋白与LC3蛋白在体外相互作用的情况;利用免疫荧光技术观察OPTN蛋白在细胞内的定位情况,以OPTN一抗结合细胞内源的OPTN后以Cy5(goat-anti-mouse,红光)偶联的二抗荧光显示内源OPTN的分布定位;构建重组载体pRFP-C-RS-shOPTN,经鉴定正确后转染HEK293FT细胞,荧光显微镜下观察shRNA转染情况,蛋白质印迹法检测OPTN蛋白表达检测其干扰效率;沙门氏菌感染实验检测沙门氏菌在细胞内的增殖,进一步检测OPTN蛋白干扰后对OPTN蛋白作为自噬受体功能的影响;还构建了pGBKT7-OPTN酵母表达载体,利用酵母双杂交技术筛选E3库。
　　结果:酶切鉴定和测序结果都证明了各种质粒构建成功。GSTPull-down实验表明,在体外条件下,OPTN蛋白与LC3蛋白存在相互作用。免疫荧光实验表明,在HEK293FT细胞中,OPTN蛋白主要分布在细胞质中。酵母双杂交也筛选出了相应的E3ligase。
　　结论:通过GSTPull-down、免疫荧光、酵母双杂交等实验证明参与细胞凋亡调控,、NF-KB信号通路,抗病毒和细菌感染的作用机制。为进一步研究OPTN在青光眼、神经退行性疾病中的作用机制奠定了研究基础。

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1.引言

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1 主要仪器

2.1.2 质粒、菌株和细胞株

2.1.3 主要材料

2.1.4 试剂

2.2 实验方法

2.2.1 细菌感受态细胞的制备

2.2.2质粒的制备和转化

2.2.3 shRNA的设计

2.2.3 质粒的构建

2.2.4 酵母双杂交实验

2.2.5 细胞培养

2.2.6 GST pull-down

2.2.7 细胞免疫荧光

2.2.9 Western Blot

2.2.10 沙门氏菌感染实验

3. 结果

3.1重组载体的鉴定

3.2 GST Pull-down

3.2.1 OPTN蛋白和GST-LC3融合蛋白的制备

3.3免疫荧光

3.4重组载体pRFP-C-RS-shOPTN的干扰实验

3.4.1重组载体pRFP-C-RS-shOPTN的转染

3.4.2 检测内源性OPTN的表达

3.4.3 外源性OPTN表达

3.5 Western blot检测optn蛋白对NF-κB信号通路的影响

3.6 沙门氏菌感染法检测干扰效应

3.7 酵母双杂交实验

4. 讨论

5. 结论

6. 对本课题的进一步设想

参考文献

附录

致谢

综述