共表达GM-CSF和IL-2腺病毒载体的构建及在人骨髓间充质干细胞的表达

摘要

【背景】:树突状细胞瘤苗是目前最常用的肿瘤特异性T细胞免疫治疗策略之一,而肿瘤原位活化树突状细胞是本领域一个重要的研究方向,如何将树突状细胞和T细胞活化因子运送至肿瘤局部是有待解决的难题之一。利用人骨髓间充质干细胞具有肿瘤趋向性和低免疫原性的特性,将树突状细胞和T细胞活化因子导入骨髓间充质干细胞后运送至肿瘤局部表达可能是解决上述难题的方案之一。
　　【目的】:构建共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)GM-CSF和白介素2(Interleukin-2, IL-2)的5型腺病毒载体(Ad5 GM-CSF-IL-2),感染人骨髓间充质干细胞,检测GM-CSF和IL-2的表达水平和持续时间,为体内活化树突状细胞和T细胞提供实验依据。
　　【方法】:实验于2011-6/2012-12在解放军北京军区总医院生物治疗中心实验室完成。用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞后再用 RNA 提取试剂盒提取总RNA,以此为模板用RT-PCR方法扩增GM-CSF和IL-2基因cDNA,PCR扩增片段分别插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表达载体中,再利用脑心肌炎病毒内部核酸进入位点(Internal ribosomal entry sites, IRES)序列,构建腺病毒载体穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2。采用AdMaxTM FLP重组腺病毒载体体系,将穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2与pBGHfrtDE1,3 FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad GM-CSF-IL-2。Ad GM-CSF-IL-2以100 pfu/细胞的感染复数感染常规培养至第三代的人骨髓间充质干细胞,2h后,经 10 Gy的g射线照射使其失去增值能力,分别用GM-CSF和IL-2 ELISA试剂盒在不同的时间点检测细胞上清中GM-CSF和IL-2蛋白的水平。
　　【结果】:经测序证实,克隆获得的GM-CSF、IL-2 cDNA 序列分别与GenBank NM_000758(435 bp)和GenBank NM_000586(462 bp)提供的序列完全一致。在腺病毒穿梭质粒pDC515的多克隆位点中,通过IRES序列将GM-CSF和IL-2串联起来,构成pDC515 GM-CSF-IL-2穿梭质粒,脂质体Lipofectamine 2000TM将上述穿梭质粒与pBGHfrtDE1,3 FLP腺病毒骨架质粒共转染至293包装细胞,通过293细胞空斑形成,获得Ad5 GM-CSF-IL-2毒种,冻融裂解后提取DNA,分别用GM-CSF和IL-2引物鉴定,可获得两条与GM-CSF和IL-2基因片段大小一致的片段；毒种反复扩增、CsCl纯化获得1010～1011pfu的病毒滴度。以感染复数为100 pfu/细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞,感染12 h即可在上清中检测到两种细胞因子的表达,至48-96 h表达达到高峰,以后表达逐步缓慢地下降,至第7天两种细胞因子仍然有较高的表达。
　　【结论】:用AdMaxTMFLP重组腺病毒载体可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接GM-CSF和IL-2两个基因,均获得高效表达。AdGM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后可连续7天高水平的分泌GM-CSF和IL-2。以人骨髓间充质干细胞为载体细胞传送GM-CSF和IL-2的肿瘤免疫治疗有潜在的应用前景。

目录

封面

目录

英文缩略词表(Abbreviation)

中文摘要

英文摘要

前言

实验材料和方法

实验材料

实验方法

结果

1. GM-CSF和IL-2基因的克隆

2. Ad5 GM-CSF-IL-2的构建

3. 人骨髓间充质干细胞的形态特征 见图2。

4. GM-CSF和IL-2在人骨髓间充质干细胞的表达

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

综述