氰戊菊酯通过雌激素干扰特性影响青春期雌鼠海马神经发育的体内研究

摘要

研究背景氰戊菊酯是Ⅱ型拟除虫菊酯农药中常见的一种,具有低毒、高效、低残留等特点,随着农药滥用、使用剂量不断增加,氰戊菊酯的危害引起了广泛关注。以往关于氰戊菊酯神经毒性的研究主要基于钠离子通道的毒性作用,这种作用机制可以较好解释氰戊菊酯急性毒性作用,但不能很好地解释其较长时期的毒性,尤其是神经发育毒性。本课题组早期发现,出生后早期暴露氰戊菊酯会影响小鼠的神经行为发育及学习记忆。也有研究表明,青春期暴露氰戊菊酯会损害认知功能和行为发育,并且对雌鼠的损害较雄鼠更严重。已知雌激素对中枢神经系统,尤其是海马结构的发育和功能具有重要的调节作用,而氰戊菊酯具有雌激素干扰特性。氰戊菊酯很可能通过干扰雌激素作用而影响海马神经发育。
　　研究目的青春期(出生后28～56天,PND28～56)雌鼠行卵巢切除术基本消除内源性循环雌激素后,给予氰戊菊酯和/或雌激素,观察其一般发育情况、行为和海马细胞形态,以期探讨氰戊菊酯雌激素干扰特性在神经发育毒性中的作用。
　　研究方法四周龄ICR雌鼠进行双侧卵巢切除(OVX),同时设立假手术(sham)组,待恢复性喂养一周后随机分组处理,分别为sham对照、sham+氰戊菊酯(FEN,5μg/g)、OVX对照、OVX+雌激素(E2,10μg/g)、OVX+FEN、OVX+来曲咗(Let,1μg/g)、OVX+E2+Let、OVX+E2+FEN、OVX+E2+FEN+Let,每组10只,经腹腔注射给药,每天1次,连续7天,末次染毒24h后,半数动物进行行为学实验,包括旷场实验和Morris水迷宫(7天程序),测试小鼠的学习记忆能力。另一半动物经麻醉、心脏灌注、分离脑组织,多聚甲醛固定、梯度脱水后,冰冻切片(20μm),-40℃保存,免疫荧光组织化学技术检测海马各区的神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)和神经干细胞(nestin)。
　　结果实验期间小鼠注射位置未出现炎症反应,OVX小鼠及 sham小鼠活动、神态等一般生长发育指标未见异常,但是OVX组小鼠体重增加略多于sham组小鼠。在旷场实验中,氰戊菊酯可延长sham组小鼠在第一格的潜伏期(与sham对照组比较,P<0.05);OVX后给予E2、FEN、E2+Let、FEN+Let处理可明显缩短小鼠在第一格的潜伏期(与OVX对照组相比,皆P<0.05);OVX后给予E2+FEN、E2+FEN+Let处理小鼠可减少站立次数,增加在中央格时间(与OVX对照组比较,P<0.05),旷场试验结果显示,sham处理小鼠接触FEN、OVX小鼠接触FEN同时给予E2会引起小鼠在陌生环境的自主性探索能力下降,而OVX后接触FEN不给予 E2未明显影响小鼠自主性探索能力。Morris水迷宫测试中,sham组小鼠登台潜伏期随训练天数的增加明显缩短,但FEN可延长其在第五天、第六天的登台潜伏期(与sham对照组比较,P<0.05),而对OVX小鼠未显示明显影响;若同时补充E2,则FEN可延长OVX小鼠在第五天、第六天的登台潜伏期(与OVX对照组比较,P<0.05);单独给予E2或E2+Let均能明显缩短OVX小鼠的登台潜伏期。在随后的探索实验中也发现,FEN减少了sham小鼠穿越原目标平台的次数(与sham对照组比较,P<0.05),给予FEN同时也给予E2减少了OVX小鼠穿越原目标平台的次数(与OVX对照组比较,P<0.05)。形态学观察发现,FEN可引起sham组小鼠海马CA1、CA3、DG区神经元缺失,CA3、DG区星形胶质细胞代偿性增加(与sham对照组比较,P<0.05);OVX可引起神经元的缺失和星形胶质细胞的增生,但补充E2能够减轻这种损害作用,OVX后单独给予FEN或Let并未明显影响神经元和星形胶质细胞数量,但同时给予 E2和FEN时则会加重神经元缺失,引起星形胶质细胞增生和神经干细胞数量增加(与OVX对照组比较,P<0.05)。
　　结论存在循环雌激素时,青春期接触氰戊菊酯会损害小鼠的自发性活动及学习记忆能力,撤销循环雌激素后,不管是否使用Let阻断局部雌激素合成,氰戊菊酯对小鼠自发性活动及学习记忆能力均无明显影响。补充外源性雌激素能提高OVX小鼠自发性活动及学习记忆能力,且与存在循环雌激素(sham对照组)时无异;但同时给予氰戊菊酯则明显损害OVX小鼠的自发性活动及学习记忆能力。上述改变的细胞病理学基础可能与海马神经元缺失、星形胶质细胞和神经干细胞代偿性增加有关。这些结果提示,雌激素干扰特性在氰戊菊酯影响青春期雌鼠海马神经发育中起到重要作用。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 主要试剂和仪器

2.2 动物来源、处理和制备样品

2.3 实验程序及步骤

2.4统计学处理

3 结果

3.1 青春期接触氰戊菊酯和/或雌激素对小鼠发育情况的影响

3.2 青春期暴露氰戊菊酯和/或雌激素对小鼠自主探索能力和行为的影响

3.3 青春期暴露氰戊菊酯和/或雌激素对小鼠空间学习记忆的影响

3.4 氰戊菊酯对小鼠海马各分区神经元缺失情况的影响

3.5 氰戊菊酯处理对星形胶质细胞标志物GFAP表达的影响

3.6 OVX小鼠补充外源性E2减轻海马神经元缺失

3.7 来曲咗处理未改变海马神经元（NeuN）和星形胶质细胞（GFAP）阳性细胞数

3.8 补充外源性E2后给予FEN处理加重海马神经元缺失和星形胶质细胞增生

3.9 补充外源性E2后给予FEN使海马DG区神经干细胞表达增多

4 讨论

4.1 实验动物的选择

4.2 染毒剂量的选择

4.3 青春期接触氰戊菊酯和/或雌激素会损害小鼠的学习记忆能力

4.4 青春期接触氰戊菊酯和/或雌激素损害小鼠学习记忆能力的可能机制

4.5 研究的优势和不足

5 结论

6 展望

参考文献

个人简介

致谢

综述