黄芪提取物联合5-Fu/CDDP治疗胃癌及IL-6/STAT3信号通路在其机制中的作用研究

摘要

第一部分:黄芪提取物联合5-Fu/CDDP对人胃癌SGC-7901细胞株和裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制研究
　　目的:在体内外分别观察黄芪提取物(Astragalusextract,AE)单独或联合5-氟尿嘧啶/顺铂(5-Fu/CDDP)对人胃癌SGC-7901细胞和对人胃癌SGC-7901细胞移植裸小鼠模型肿瘤生长的抑制作用,检测其对肿瘤细胞增殖和凋亡以及IL-6/STAT3信号通路的影响。分析黄芪提取物单独或联合5-Fu/CDDP的作用结果,探讨其是否具有协同作用及其可能的作用机制。
　　方法:体外实验采用MTT方法检测SGC-7901细胞的增殖抑制率,用Hoechst33258染色和流式细胞仪检测SGC-7901细胞的凋亡。体内实验通过构建人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤动物模型,待肿瘤生长至100-300mm3后将合格动物随机分为7组,分别为空白对照组、5-Fu组(50mg/kg)、CDDP组(4mg/kg)、AE(3g/kg)组、AE(6g/kg)组、AE+5-Fu组(6g/kg+50mg/kg)、AE+CDDP组(6g/kg+4mg/kg)。每组5只,共给药3周进行干预治疗。观察AE单独或联合5-Fu/CDDP治疗对裸小鼠移植瘤生长及增殖的影响。采用ELISA检测裸鼠血清中IL-6和VEGF的水平。采用免疫组化和WesternBlot方法分析肿瘤组织中IL-6、STAT3及其磷酸化、VEGF、Survivin、Bax和Bcl-2蛋白表达。分析AE单独及联合5-Fu/CDDP治疗对裸鼠移植瘤生长增殖的影响,进一步探讨其对肿瘤组织中凋亡相关蛋白(Survivin、Bax和Bcl-2)和VEGF蛋白表达的影响。
　　结果:体外实验结果显示,黄芪提取物、5-Fu和CDDP均能抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞生长,且具有浓度依赖性。黄芪提取物联合5-Fu/CDDP对SGC-7901细胞生长的抑制率明显高于单用黄芪提取物组(P<0.01)。黄芪提取物和5-Fu、CDDP均能诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡,而黄芪提取物联合5-Fu/CDDP组胃癌细胞的凋亡率均明显高于黄芪提取物和5-Fu、CDDP单独用药组(P<0.01)。体内实验研究结果表明,5-Fu组、CDDP组和黄芪提取物联合5-Fu/CDDP给药组可显著抑制裸鼠移植瘤的生长,减小肿瘤的体积和瘤体的重量,与对照组比较具有显著性差异。AE联合5-Fu/CDDP给药组裸鼠移植瘤平均瘤体体积和瘤体重量与AE及5-Fu和CDDP单用药组比较,差异均具有显著性(P<0.05)。AE高、低剂量组裸鼠肿瘤体积和瘤体重量虽较对照组偏小或减少,但无统计学差异。各给药治疗组可不同程度降低裸鼠血清中IL-6和VEGF的水平,尤其黄芪提取物联合5-Fu/CDDP给药组最为显著。各给药组可抑制肿瘤组织中IL-6蛋白表达,并抑制STAT3的磷酸化,使STAT3磷酸化表达下调,从而阻断磷酸化的STAT3转位入核,导致其下游Survivin和Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,促进肿瘤细胞的凋亡,同时抑制其下游VEGF蛋白表达,从而抑制肿瘤组织血管的形成。
　　结论:1)黄芪提取物联合5-Fu/CDDP应用能产生协同作用,可抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖,促进其凋亡;并可抑制裸鼠移植瘤的生长。
　　2)黄芪提取物联合5-Fu/CDDP应用产生协同作用可能的作用机制与其具有抑制肿瘤组织中IL-6/STAT3的激活,阻断磷酸化的STAT3转位入核,导致其下游Survivin、Bcl-2和VEGF蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调有关。
　　第二部分:IL-6等相关细胞因子激活人胃癌组织中STAT3信号通路以及黄芪提取物对胃癌患者免疫功能的调节作用
　　目的:信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路在胃癌发生发展过程中发挥重要的作用。通过检测胃癌患者血清中IL-6水平以及IL-6/STAT3信号通路在胃癌组织中的表达与活化等变化。分析其潜在的肿瘤病理学意义并借此探讨其在胃癌发生发展过程中可能存在的潜在分子机制。另外,进一步观察胃癌患者手术前后免疫细胞的变化以及胃癌患者化疗期间协同黄芪提取物治疗后对患者免疫细胞的影响,初步探讨其可能的免疫调节作用机制。
　　方法:收集安徽医科大学第一附属医院干部普通外科近三年手术切除的71例新鲜胃癌组织标本及其距肿瘤约5cm的正常胃组织30例,同时采集部分胃癌病人术前、术后1周、术后1月及化疗期间血液标本5ml。用ELISA法检测患者血清中IL-6、IL-10及VEGF水平。石蜡组织进行免疫组织化学检测IL-6、STAT3、VEGF和Survivin蛋白表达。利用蛋白印迹技术(Westernblot)检测胃癌组织和癌旁组织中IL-6、STAT3、VEGF和Survivin的蛋白表达情况。采用流式细胞仪分析外周血中T淋巴细胞亚群及NK细胞比例。
　　结果:胃癌患者术前外周血中IL-6、IL-10和VEGF水平升高,术后1周和术后1月患者外周血中IL-6、IL-10和VEGF水平降低,免疫组化和Westernblot结果显示,IL-6的表达上调往往伴随着STAT3的激活,因此,IL-6可能是导致胃癌组织中STAT3信号途径活化的重要信号分子,同时STAT3信号途径激活导致其调控的下游基因VEGF和Survivin的表达明显上调。另外,胃癌患者术前CD3+、CD4+和NK细胞比例降低,术后1月患者外周血液中CD3+、CD4+和NK细胞比例明显升高,CD8+比例降低,其CD4+/CD8+比值升高。胃癌患者化疗期间给予黄芪提取物治疗可提高外周血液中CD3+、CD4+和NK细胞比例,增加CD4+/CD8+比值。
　　结论:1)胃癌患者的胃癌组织中STAT3的激活以及STAT3引起的下游靶基因VEGF和Survivin表达上调可能与IL-6的高表达密切相关。
　　2)T淋巴细胞亚群和NK细胞参与了胃癌的发生发展过程。黄芪提取物协同治疗可提高胃癌患者化疗期间外周血液中CD3+、CD4+和NK细胞比例,增加CD4+/CD8+比值,对胃癌患者的免疫功能起到一定的调节作用。

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前言

第一部分 黄芪提取物联合5-Fu/CDDP对人胃癌SGC-7901细胞株和裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制研究

1. 材 料

1.1 细胞株

1.2 实验动物

1.3 实验药物及试剂

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 肿瘤细胞增殖抑制实验

2.3 荧光素染料Hoechst33258检测肿瘤细胞的凋亡

2.4 流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡

2.5 制备移植瘤模型及给药

2.6 统计学处理

3 实验结果

3.1 体外实验

3.2 体内实验

4. 讨论

5. 小 结

第二部分 IL-6等相关细胞因子激活人胃癌组织中STAT3信号通路以及黄芪提取物对胃癌患者免疫功能的调节作用

1 材料与方法

1.1 实验药品与试剂

1.2 仪器设备

1.3 临床资料

1.4 患者血清中IL-6、IL-10和VEGF水平检测：

1.5 免疫组化检查：

1.6 Western Blot检测：

1.7 手术前、手术后1周及手术后1月患者免疫功能测定

1.8 黄芪提取物（黄芪颗粒）对胃癌化疗患者T细胞亚群及NK细胞的调节作用

1.9 统计学处理

2 实验结果

2.1 胃癌患者术前、术后1周及术后1月血清中IL-6、IL-10和VEGF水平分析

2.2 IL-6、STAT3、VEGF 和Survivin蛋白在胃癌组织和癌旁组织中表达及分布情况统计分析

2.3 Weatern Blot 检测IL-6、p-STAT3、STAT3、VEGF 和Survivin蛋白在人胃癌组织和癌旁组织中表达情况

2.4 胃癌患者术前、术后1周及术后1月外周血中T细胞亚群及NK细胞分析

2.5 黄芪提取物对胃癌化疗患者免疫功能的影响

3. 讨论

4. 小 结

5. 结论

参考文献

附录 一

致谢

附录 三 综述