支架蛋白RACK1及其突变体与氯离子通道蛋1(CLIC1)相互作用的研究

摘要

目的：为了研究RACK1及其突变体与氯离子通道蛋白CLIC1的相互作用，运用分子克隆技术构建带FLAG标签的RACK1突变体的真核表达质粒，原核表达质粒和CLIC1的原核表达质粒，通过酵母双杂交，瞬时转染，免疫荧光，免疫共沉淀和GST-pulldown等实验研究在体内外实验中蛋白质的共定位及相互作用。
　　方法：以pcDNA3.1-RACK1重组质粒为模板，运用分子克隆技术构建重组酵母质粒pGBKT7/pGADT7-RACK1，pGBKT7/pGADT7-RACK1-N(1-138)，pGBKT7/pGADT7-RACK1-C(130-317)，分别与实验室保存的CLIC1的酵母表达质粒，共同转化到酵母细胞（ΑH109）中，并在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培养基上进行营养筛选，对长出的克隆进行半乳糖苷酶（X-α-gαl）活性测定，通过观察克隆变蓝情况来验证RACK1及其突变体是否与CLIC1存在相互作用；构建真核表达质粒pcDNA3.1-RACK1-N(1-138)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1-C(130-317)-FLAG及原核表达质粒pGEX-5X-3-RACK1-N(1-138)、pGEX-5X-3-RACK1-C(130-317)、pGEX-5X-3-CLIC1；用激光共聚焦荧光显微镜观察蛋白在 COS7细胞内的定位情况；将RACK1全长及其缺失突变体转染入HEK293T或COS7细胞中，分别提取胞质蛋白与核蛋白，利用Western blot法检测蛋白在胞质与胞核中表达情况，进一步说明蛋白质在细胞内的定位情况；并与pCDGFP-CLIC1共转染到HEK293T或COS7细胞中，通过免疫共沉淀技术检测RACK1及其突变体蛋白与CLIC1蛋白在体内是否相互作用；从转染了相关质粒的BL21感受态细胞中纯化GST-CLIC1，GST-RACK1，GST-RACK1-N和GST-RACK1-C融合蛋白，然后进行GST-pulldown实验，检测蛋白在体外相互作用情况。
　　结果：酶切鉴定和测序结果表明成功构建了实验相关的重组质粒。酵母双杂交实验显示，共同表达了CLIC1和RACK1或突变体(RACK1-N)这两种蛋白的酵母细胞在SD3-培养基中能够正常生长，且克隆在进行α-半乳糖苷酶活性测定后大多数颜色变蓝，即证明二者可能存在相互作用。分离胞质蛋白与核蛋白，Western blot结果表明在胞质与胞核中均有表达，以细胞质为主，共聚焦荧光显微镜观察到野生型RACK1蛋白和突变体蛋白主要分布在细胞质与核膜处，细胞核中也有一定量的分布，与在细胞质细胞核均有分布的CLIC1蛋白有共定位现象存在。免疫共沉淀实验表明野生型RACK1蛋白及突变体蛋白都和CLIC1蛋白存在相互作用。在最佳条件下成功诱导表达GST-CLIC1蛋白、GST-RACK1蛋白、GST-RACK1-N蛋白、GST-RACK1-C蛋白，GST-pulldown实验表明野生型RACK1蛋白及突变体蛋白都可以和CLIC1蛋白相互作用。
　　结论：酵母双杂交实验表明野生型RACK1及其突变体蛋白与CLIC1蛋白可能存在相互作用，免疫荧光实验，免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验进一步证实它们之间的相互作用。

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英文摘要

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 实验结果

3.1 构建重组质粒

3.2 酵母双杂交实验

3.3 细胞免疫荧光

3.4 RACK1及其突变体蛋白在细胞核细胞质中的表达

3.5 RACK1及其突变体蛋白与CLIC1蛋白的体内外相互作用分析

4 讨 论

5 结论

6 对本课题的展望

参考文献

附录

致谢

综述: 支架蛋白RACK1的结构和功能