4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯通过PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导人乳腺癌细胞分化

摘要

维甲酸类化合物在细胞生长、分化、发育及维持机体生理平衡中发挥广泛的效应，可以通过与细胞核内维甲酸受体(RARs)及维甲类受体(RXRs)结合作用于DNA应答元件，调节靶基因的表达，发挥抑制细胞增殖和诱导分化作用。全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA)是目前应用最广泛的诱导分化剂之一，主要用于急性早幼粒白血病的临床治疗，由于其存在维甲酸综合征等不足限制其进一步临床使用。本课题组以ATRA为先导化合物，将其碳链末端极性基团进行结构修饰，合成一系列全新的维甲酸衍生物，通过药效学筛选发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化活性，有望成为一种新型抗肿瘤药。课题组前期观察发现ATPR对乳腺癌细胞MCF-7具有诱导分化作用，而乳腺癌根据雌激素受体的不同分为阳性性乳腺癌和阴性乳腺癌，本实验旨在观察 ATPR对雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231是否具有诱导分化作用，并探究ATPR对不同雌激素受体水平的乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231发挥诱导分化作用的机制。
　　目的：观察4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-Anino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retimate，ATPR)对雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231抑制增殖诱导分化作用，并探讨其可能的诱导分化机制。
　　方法：
　　1.新型维甲酸类衍生物ATPR(药物浓度分别为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231后，MTT法检测对细胞活性的影响；细胞计数法绘制细胞生长曲线；瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态学变化；酶联免疫法检测乳腺癌细胞分化标志物粘蛋白(MUC-1)活性；流式细胞术测定细胞周期的变化。
　　2. ATPR(10-5 mol/L)、ATRA(10-5 mol/L)、雌二醇 E2(10-6 mol/L)、ATRA+E2和ATPR+E2及不同浓度 ATPR(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)+E2作用于人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231后，瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态学变化；酶联免疫法检测乳腺癌细胞分化标志物粘蛋白(MUC-1)的活性；流式细胞术检测细胞周期的变化。
　　3.选择两种不同雌激素受体水平人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231为实验对象，实验分组如下：空白对照组(DMEM)、溶剂对照组(含0.05％无水乙醇)、阳性药对照组ATRA组(浓度为10-5 mol/L)及实验组ATPR(浓度为10-5 mol/L)，采用q-RT-PCR和Western blot技术检测两种人乳腺癌细胞株中维甲酸受体RARα，RARβ，RARγ、维甲类受体RXRα、RXRβ、RXRγmRNA和蛋白的表达。
　　4.选择两种不同雌激素受体水平人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231为实验对象，实验分组如下：空白对照组(DMEM)、溶剂对照组(0.05%无水乙醇)、阳性药对照组ATRA组(浓度为10-5 mol/L)及实验组ATPR(浓度为10-5 mol/L)采用Western Blot技术检测两种人乳腺癌细胞株中雌激素受体 ERα、ERβ和PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。
　　结果：
　　1.ATPR(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)作用后能抑制MDA-MB-231细胞的增殖，抑制作用于72 h达峰值，并且随着药物剂量的增加，抑制效应增强。瑞氏-吉姆萨染色结果显示ATPR可以诱导MDA-MB-231细胞形态趋于成熟分化。与对照组比较，ATPR用药组 MDA-MB-231细胞上清中MUC-1含量下降，10-5 mol/L时 MUC-1含量下降最显著(P<0.01)。流式细胞术结果显示 ATPR用药后MDA-MB-231细胞G0/G1期细胞表达量增加，S期减少。
　　2. ATPR对E2刺激的MDA-MB-231细胞诱导分化作用的影响。瑞氏-吉姆萨染色结果表明，E2单独用药后对细胞密度及形态均无影响，ATPR用药后细胞形态发生改变，出现分化程度增加，ATPR(10-5 mol/L)+E2组细形态发生明显改变，ATPR(10-6~10-9 mol/L)+E2组，细胞形态随药物浓度的降低，变化越小。ELISA结果显示，E2单独作用后 MUC-1含量未发生变化，ATPR(10-5 mol/L)+E2用药后MUC-1含量降低显著（P＜0.05）。ATPR(10-6~10-9 mol/L)+E2组，MUC-1含量随药物浓度降低下降越小。流式细胞术结果显示，E2组对细胞周期无明显影响，ATPR单独作用后，ATPR(10-6-10-9 mol/L)+E2组，将MDA-MB-231细胞的周期阻滞在G0/G1期比例升高，S期比例降低，并且细胞周期随药物浓度降低越接近于对照组。
　　3. ATPR(10-5 mol/L)作用后，q-RT-PCR和Western blot结果显示，与对照组相比，在MCF-7细胞中，RARβ和RXRα表达量升高，RARγ表达下降，RARα表达无明显变化，RXRβ和RXRγ表达无明显变化。在MDA-MB-231细胞中，RARγ表达下降，RARα和RARβ无明显变化，RXRα、RXRβ和RXRγ无明显变化。
　　4. ATPR(10-5 mol/L)作用后，Western-blot结果显示，与对照组相比，在MCF-7细胞中，ERα蛋白表达无明显变化，ERβ蛋白表达升高。在MDA-MB-231细胞中，ERα蛋白表达非常低，ERβ蛋白表达升高。
　　5. ATPR(10-5 mol/L)作用后，Western-blot结果显示，与对照组相比，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，PTEN蛋白表达升高，p-AKT蛋白表达降低。
　　结论：
　　1. ATPR能够抑制雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖并诱导其分化程度增加，并且E2刺激对ATPR发挥诱导分化作用的药效学不产生影响。
　　2. ATPR对不同雌激素受体表达的人乳腺癌细胞株中RARs和RXRs的影响不同。
　　3. ATPR可能通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥对人乳腺癌细胞株的抑制增殖诱导分化作用。

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第一部分4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的诱导分化作用

1前言

2 实验材料

3 实验方法

4结果

5 讨论

6 小结

参考文献

第二部分4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对雌激素受体不同人乳腺癌细胞株诱导分化作用的可能机制研究

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5讨论

6 小结

参考文献

附录

致谢

综述: 维甲酸及其受体在乳腺癌中的研究进展