临床分离志贺菌的质粒介导磷霉素耐药基因检测及其与β-内酰胺酶基因的相关性研究

摘要

目的：
　　了解临床分离志贺菌对常用抗菌药物的耐药情况和质粒介导的磷霉素耐药基因的种类、分布及传播方式，为临床合理选择抗生素提供指导。
　　研究临床分离志贺菌质粒介导的磷霉素耐药基因与β-内酰胺酶基因的相关性。
　　材料与方法：
　　菌株来源
　　263株志贺菌为安徽省细菌耐药监测中心2011年9月~2012年10月在临床标本中分离获得的非重复菌株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，ESBLs阳性菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603，转移接合试验受体菌大肠埃希菌J53AZR以及fosA、fosA3和fosC2基因阳性标准株均为安徽省细菌耐药监控中心保存菌株。
　　方法：
　　1.MH琼脂倍比稀释法测定263株志贺菌对磷霉素等12种抗生素的最低抑菌浓度(the minimal inhibitory concentration，MIC)，大肠埃希菌ATCC25922为质控菌。
　　2.煮沸法提取磷霉素耐药菌株总基因组DNA为模板，利用fosA、fosA3以及fosC2的特异性引物以聚合酶链反应法（polymerase chain reaction，PCR)扩增质粒介导的磷霉素耐药基因，测序并拼接PCR产物，明确质粒介导的磷霉素耐药基因是否存在突变。
　　3.质粒介导的磷霉素耐药基因阳性菌株与大肠埃希菌 J53AZR进行接合实验，M-H琼脂倍比稀释法测定受体菌及接合子对12种常用抗生素的MIC值。
　　4.肠杆菌科基因间的重复序列 PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR)法对质粒介导的磷霉素耐药基因阳性菌株进行同源性分析。
　　5.在质粒介导的磷霉素耐药基因阳性志贺菌中进行产ESBLs检测，PCR法明确β-内酰胺酶基因型，接合实验验证质粒介导的磷霉素耐药基因与β-内酰胺酶基因是否同时发生转移。
　　6.煮沸法提取的质粒介导的磷霉素耐药基因及β-内酰胺酶基因均阳性的接合子菌株总基因组DNA为模板，多重PCR法对其携带的质粒进行不兼容性分组。
　　结果：
　　1.263株志贺菌对磷霉素的耐药率为9.5％、中介率为2.7%，氯霉素的耐药率最高、达到87.8%，亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦均有极高的敏感性，敏感率介于97%~100%，三代头孢菌素的敏感率介于50.6%~72.2%，左氧氟沙星和环丙沙星的敏感率分别为60.5%和64.3%。
　　2.25株磷霉素耐药志贺菌中的18株检测到fosA3基因，未检测到fosA及fosC2基因，fosA3基因的GenBank注册号为KJ716852。13株fosA3基因阳性志贺菌与大肠埃希菌J53AZR接合成功，接合子均可检测到fosA3基因，接合子与受体菌相比对磷霉素的MIC值有明显提高。ERIC-PCR法证实部分fosA3阳性志贺菌存在同源性。
　　3.18株fosA3阳性志贺菌均产ESBLs，其中1株仅携带OXA基因，3株同时携带OXA、TEM和CTX-M基因，14株同时携带OXA和CTX-M基因；测序分析显示CTX-M型基因分别为CTX-M-15、CTX-M-55、CTX-M-123，CTX-M-123基因的GenBank注册号为KJ871006，TEM基因均为TEM-1,OXA基因均为OXA-30；18株志贺菌中的13株接合成功，接合子与受体菌相比对磷霉素和三代头孢的 MIC值明显提高，接合子均携带供体菌的相应耐药基因。
　　4.13株接合子均携带IncF型质粒，其中3株携带HI2型复制子、2株携带Il-Ir型复制子、1株携带N型复制子。
　　结论：
　　1.安徽地区的志贺菌对常用抗菌药物耐药现象严重，但磷霉素仍有较高的敏感性，适合临床运用于治疗细菌性痢疾。
　　2.证实了安徽地区存在质粒介导的志贺菌对磷霉素的耐药现象，且是国内首次在志贺菌中检测到了质粒介导的磷霉素耐药基因。
　　3.携带fosA3的接合子对磷霉素的MIC值与受体菌相比有显著的升高且均高度耐药，表明fosA3可导致志贺菌对磷霉素高度耐药。
　　4.携带fosA3的志贺菌具有较高的接合率，且存在同源性，表明fosA3阳性志贺菌极易传播，导致磷霉素耐药性的扩散。
　　5.可能存在质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3与β-内酰胺酶基因位于同一质粒上共同传播，引起多重耐药。

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缩略语中英文对照表

中文摘要

英文摘要

第一部分正文临床分离志贺菌的耐药性分析及质粒介导的磷霉素耐药基因检测

1.前 言

2.材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分正文磷霉素耐药基因fosA3阳性志贺菌的ESBLs检测及基因型分析

1前 言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述: 磷霉素耐药机制研究进展