4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人肺腺癌A549细胞株增殖凋亡的影响及其可能机制

摘要

研究背景：肺癌是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率均居所有癌症之首。近年来，虽然肺癌诊断及治疗方式不断进步，但肺癌患者发病率死亡率不断上升，因此探索新型高效抗肿瘤药物势在必行。
　　目的：探讨全反式维甲酸（ATRA）新型衍生物4-氨基-2-三氟-甲基苯基维甲酸酯（ATPR）在体外对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制的研究。
　　方法：以A549细胞为研究对象，经ATPR及ATRA处理A549细胞48 h，MTT及平板克隆形成实验观察其对细胞的增殖及单细胞克隆形成能力的影响；Western blot检测ATPR对增殖相关蛋白ASPP家族(P53凋亡刺激蛋白家族)、WP53(野生型P53)及其下游P21、MDM2蛋白和凋亡相关蛋白 BCL-2、Bax、pro-caspase3、NF-κB(P65)蛋白的表达水平的影响。Hoechst染色用来观察观察ATPR对A549细胞凋亡的作用。结果：MTT实验中，不同浓度的ATPR及ATRA（10、20、25、40、50、75、100μmol/L）处理96孔板中A549细胞48 h，经MTT孵育4 h后测定各组吸光度，并换算成各组细胞存活率。结果发现 ATRA处理后各浓度组之间细胞存活率无明显差异；而经ATPR处理后，从50μmol/L开始到100μmol/L浓度组，随着ATPR浓度升高，细胞存活率逐渐降低。说明ATPR的浓度调至50μmol/L时，对A549细胞有明显的增殖抑制作用。因此，50μmol/L被选为后续实验的主要药物处理浓度。平板克隆形成实验中，ATPR及ATRA处理后的单个细胞接种于6孔板孵育8-10天后，结晶紫染色处理。再用肉眼及倒置显微镜下观察，与对照组相比，ATPR及ATRA组克隆数目及单个克隆细胞数量减少。且相同浓度下，ATPR组克隆数目及单个克隆细胞数量均较ATRA组减少。经ATPR及ATRA处理细胞48 h后，用 Western blot检测ASPP家族、WP53及下游P21、MDM2蛋白表达水平并进行统计学分析，与对照组相比，ATPR及ATRA处理后iASPP、P21灰度值均有不同程度下降，WP53、MDM2灰度值均有不同程度上升（P<0.05）。而ASPP1及ASPP2经药物处理后灰度值变化与其对照组相比无统计学意义。即ATPR下调iASPP、P21的表达，上调WP53、MDM2的表达，而对ASPP1、ASPP2表达无影响。通过Hoechst染色观察经ATPR及ATRA处理48 h后的A549细胞凋亡情况。倒置荧光显微镜视野下，与对照组相比，ATPR及ATRA组细胞数量较少，细胞核染色质凝集，且出现凋亡小体。且在相同浓度下，ATPR组凋亡小体数量比ATRA组增多。通过Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、Bax、pro-caspase3、NF-κB(P65)表达水平并进行统计学分析，与对照组相比，A549细胞经ATPR及ATRA处理后BCL-2、pro-caspase3、NF-κB(P65)灰度值均有不同程度下降，Bax灰度值均有不同程度上升（P<0.05）。即 ATPR下调 BCL-2、pro-caspase3、NF-κB(P65)的表达，上调Bax的表达。结论：ATPR可以抑制A549细胞增殖，促进其凋亡，ATPR抑制细胞增殖的机制可能与下调iASPP表达从而促进WP53调控的BCL-2/Bax比率下降启动细胞凋亡相关。

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1.前言

2.材料与方法

2.1主要仪器与设备

2.2药物

2.3 细胞株及其培养

2.4 细胞复苏与冻存

2.5.MTT法检测ATPR对A549细胞增殖的影响

2.6 平板克隆形成实验检测ATPR对A549细胞单克隆形成能力的影响

2.7 Hoechst 33258染色检测ATPR对A549细胞凋亡的影响

2.8 Western blot

2.9 统计学分析

3.实验结果：

3.1 ATPR抑制A549细胞增殖

3.2 ATPR抑制A549细胞克隆形成能力

3.3 ATPR诱导A549细胞凋亡

3.4 ATPR对ASPP家族蛋白表达水平的影响

3.5 ATPR对WP53及MDM2表达水平的影响

3.6 ATPR对WP53下游蛋白表达水平的影响

3.7 ATPR对pro-caspase 3及NF-κB(P65) 表达水平的影响

4.讨论

5.结论

6.实验创新点

7.对课题进一步设想

参考文献

个人简介

致谢

综述:ASPP与肿瘤