CDX2基因过表达对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织中MUC2蛋白的影响

摘要

目的:构建携带并稳定表达尾侧型同源转录因子2（CDX2）基因的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），为大鼠溃疡性结肠炎模型的基因治疗提供工具；探讨CDX2基因过表达对溃疡性结肠炎大鼠模型中MUC2蛋白的作用；
　　方法:
　　1、CDX2基因重组慢病毒载体的构建及鉴定
　　设计CDX2引物，采用PCR扩增CDX2基因片段;通过In-Fusion技术将目的基因片段连接到线性质粒载体中，然后转化感受态细胞，进行阳性克隆筛选及基因测序。将重组载体转染293T细胞，进行慢病毒包装、浓缩，并用荧光法进行滴度测定。
　　2、大鼠BMSCs的培养、转染及鉴定
　　采用骨髓贴壁法体外分离并培养雄性 Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪（FACS）检测细胞免疫表型。将携带CDX2基因的慢病毒载体转染至大鼠骨髓间充质干细胞，利用RT-PCR及Western blot等技术检测干细胞中CDX2 mRNA及蛋白的表达水平。
　　3、大鼠UC模型的诱导及分组处理
　　采用5%2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TNBS)/无水乙醇化学法诱导雌性大鼠溃疡性结肠炎（UC）疾病模型；再次采用FACS检测经慢病毒转染后的细胞免疫表型；分别将1ml生盐水（NS，B组）、骨髓间充质干细胞（BMSCs，C组）、空载慢病毒转染后的骨髓间充质干细胞（LV-BMSCs，D组）、携带CDX2的慢病毒转染后的骨髓间充质干细胞（CDX2-BMSCs，E组）经鼠尾静脉注射移植到UC模型大鼠体内，另外设未处理的大鼠为正常对照组（A组）。
　　4、干预后不同组别大鼠量化评分
　　对不同组别大鼠的急性疾病活动指数（DAI）评分；取移植治疗后7天的大鼠结肠组织肉眼及光镜下（HE染色）观察其损伤变化，并对其进行结肠组织大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index，CMDI)、组织损伤指数（The scoring criteria of tissue damage index，TDI）量化评分。
　　5、制备组织冰冻切片在荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达情况。
　　6、检测大鼠结肠组织SRY、CDX2、MUC2的表达
　　经 PCR技术检测大鼠结肠组织内是否表达雄性鼠特异性的 SRY基因，采取RT-PCR及 Western Blot技术检测不同组 CDX2 mRNA和蛋白的表达情况；用Western Blot技术检测不同组别MUC2蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1、PCR、DNA测序及WB检测结果表明成功构建重组Ubi-CDX2-MCS-3FLAG-CMV-EGFP慢病毒载体，测定滴度为2×108TU/ml。
　　2、FACS鉴定结果显示，大鼠BMSCs表达CD29、CD73、CD90，而不表达CD34和CD45，符合骨髓间充质干细胞的表型，成功完成大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养。RT-PCR及Western blot结果显示CDX2基因转染至大鼠BMSCs并能稳定表达，成功构建携带CDX2基因的BMSCs系统。
　　3、给予5%TNBS/无水乙醇灌肠处理后，大鼠出现厌食、扎堆、体重下降、腹泻等结肠炎症状，在第3天各实验组DAI评分较正常组明显增高，但组间无显著差异（F=0.39,P>0.05）；FSCS结果提示慢病毒转染后的细胞依然表现出骨髓间充质干细胞的免疫表型。
　　4、给予不同处理的骨髓间充质干细胞移植治疗后第7天，E组大鼠DAI、CMDI、TDI评分明显低于B、C、D组（P<0.05）,C、D两组分别低于B组（P<0.05），而C、D两组间无明显差异（P>0.05）。
　　5、荧光显微镜下观察各组冰冻切片发现只有 D、E两组可见大量荧光，其他组均无荧光表达，说明慢病毒转染成功。
　　6、SRY基因的PCR定性检测发现C、D、E三组在213bp处可见电泳条带，说明雄性大鼠的骨髓间充质干细胞成功移植到大鼠体内并归巢到结肠组织。通过QRT-PCR和WB技术定量检测大鼠结肠组织CDX2 mRNA、CDX2蛋白和MUC2蛋白发现，E组较B、C、D组表达增加（P<0.05），B组表达量最低，明显低于其他各组（P<0.05）,C、D两组间无差异（P>0.05）。
　　结论:
　　1、成功构建了稳定过表达CDX2基因的雄性大鼠BMSCs并移植到雌性大鼠体内；
　　2、采用5%TNBS/无水乙醇成功诱导出大鼠溃疡性结肠炎模型，为进一步的实验奠定基础；
　　3、首次通过慢病毒载体借助骨髓间充质干细胞组作为运载细胞将目的基因CDX2转染到大鼠体内过表达，探讨了该基因对大鼠UC模型中MUC2蛋白的促表达作用；
　　4、同时也证实了骨髓间充质干细胞对溃疡性结肠炎的治疗作用以及CDX2基因与溃疡性结肠炎的相关性。

目录

声明

中英文缩略词表

第一部分 尾侧型同源转录因子2慢病毒载体的构建及其转染骨髓间充质干细胞

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

6 参考文献

第二部分CDX2基因过表达对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织中MUC2蛋白的作用

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

6 参考文献

附录

1 本人简历

2 在学期间的研究成果

致谢

综述:CDX2与消化道疾病的关系

1 CDX2基因在正常胚胎和成人体内表达

2 CDX2在食管和胃肠道中的作用

3 展望

4 参考文献