黄芪甲苷对高糖环境下人肾小球系膜细胞损伤保护作用及其机制研究

摘要

目的：
　　在体外，观察高糖（high glucose，HG）环境下人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells，HMCs）的损伤情况及其黄芪甲苷（astragalosideⅣ，AS-Ⅳ）的防治作用、研究AS-Ⅳ对HMCs损伤的保护作用及其可能机制，观察Nrf2信号通路在其中的调节作用。探讨糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）的可能发病机制，为该疾病的防治提供新理论、作用靶点和为新药提供理论依据。
　　方法：
　　1.将常规培养的HMCs随机分为以下2组：（1）正常（NG）组、（2）高糖（HG）组，将各组细胞培养至规定时间（12 h、24 h、36 h、48 h、72 h）后，利用MTT方法检测其增殖情况。
　　2.将常规培养的HMCs随机分为6个时间点组：（1）NG组，（2）HG6 h组，（3）HG12 h组，（4）HG24 h组，（5）HG36 h组，（6）HG48 h组。采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot方法检测各组细胞的Nrf2、HO-1、iNOS、ICAM-1 mRNA及其蛋白的表达水平，采用试剂盒检测方法检测HMCs上清液中H2O2与MDA含量变化及 T-SOD和GSH-Px活性变化情况。
　　3.将常规培养的HMCs随机分为以下6组：（1）NG组，（2）HG组、（3）HG+AS-Ⅳ10（μmol/L）组，（4）HG+AS-Ⅳ25（μmol/L）组，（5）HG+AS-Ⅳ50（μmol/L），（6）HG+AS-Ⅳ100（μmol/L）组，各组均干预48 h。采用MTT法检测各组细胞的增殖情况，采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测各组细胞的Nrf2、HO-1、iNOS、ICAM-1 mRNA及其蛋白的表达水平，采用试剂盒检测 HMCs上清液中 H2O2与 MDA含量变化及 T-SOD和GSH-Px活性变化情况。
　　结果：
　　1. MTT方法结果显示，与正常（NG）组比较，高糖环境下HMCs呈过度增殖趋势；不同浓度AS-Ⅳ干预48 h后，与HG组比较，各给药组明显的抑制了高糖环境下HMCs过度增殖且呈剂量依赖性。
　　2. qPCR及Western blot方法结果显示，与NG组比较，不同时间点时组微弱的增加了Nrf2 mRNA及蛋白表达水平，HO-1 mRNA及蛋白表达水平在12 h和24 h时增加，在随后的36 h和48 h时又降低至正常的表达水平，增加了iNOS与ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平；不同浓度AS-Ⅳ干预48 h后，与HG组比较，各给药组明显的增加了Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平，减少了iNOS与ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平。
　　3.各试剂盒检测结果显示，与NG组比较，不同时间点时组明显的增加了细胞上清液中H2O2、MDA的含量，降低了细胞上清液中T-SOD、GSH-Px的活性；不同浓度AS-Ⅳ干预48 h后，与HG组比较，各给药组显著的降低了细胞上清液中H2O2、MDA的含量，增加了细胞上清液中T-SOD、GSH-Px的活性。
　　结论：
　　AS-Ⅳ可能通过调控抗氧化应激Nrf2信号通路（包括Nrf2、HO-1 mRNA及其蛋白表达水平），下调iNOS、ICAM-1 mRNA及其蛋白表达水平，降低高糖环境下HMCs上清液中H2O2、MDA的含量以及增加T-SOD、GSH-Px的活性,从而抑制了高糖环境下HMCs过度增殖减缓了DN的进程。

目录

声明

英文缩略词(Abbreviation)

1 前言

2 实验材料

2.1 细胞

2.2 药品

2.3 主要试剂

2.4 仪器与设备

3. 实验方法

3.1 实验试剂的配制

3.2 实验分组

3.3 HMCs的培养

3.4 噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖

3.5 蛋白免疫印迹技术（Western blot）

3.6 实时荧光定量PCR法检测mRNA表达水平

3.7 试剂盒检测法测定细胞上清液中 H2O2、MDA 的含量以及 T-SOD、GSH-Px的活性

3.8 统计学处理

4 实验结果

4.1高糖环境下的HMCs增殖的时效变化

4.2 不同时间点时高糖环境下HMCs中Nrf2 mRNA表达水平变化

4.3不同时间点时高糖环境下HMCs中Nrf2蛋白表达水平

4.4 不同时间点时高糖环境下HMCs中HO-1 mRNA表达水平

4.5不同时间点时高糖环境下HMCs中HO-1蛋白表达水平

4.6 不同时间点时高糖环境下HMCs中iNOS mRNA表达水平

4.7不同时间点时高糖环境下HMCs中iNOS蛋白表达水平

4.8不同时间点时高糖环境下HMCs中ICAM-1 mRNA表达水平

4.9不同时间点时高糖环境下HMCs中ICAM-1蛋白表达的影响

4.10 不同时间点时高糖对HMCs上清液中H2O2、MDA、T-SOD、GSH-Px含量变化的影响

4.11 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs增殖的影响

4.12 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs中Nrf2 mRNA表达水平的影响

4.13 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs 中Nrf2蛋白表达水平的影响

4.14 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs 中HO-1 mRNA表达水平的影响

4.15 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs中HO-1蛋白表达水平的影响

4.16 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs中iNOS mRNA表达水平的影响

4.17 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs中iNOS蛋白表达水平的影响

4.18 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs中ICAM-1 mRNA表达水平的影响

4.19 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs中ICAM-1蛋白表达水平的影响

4.20 AS-Ⅳ对高糖环境下HMCs上清液中H2O2、T-SOD、GSH-Px、MDA含量变化的影响

5 讨论

6. 结论

参考文献

附录

致谢

综述:糖尿病肾病的分子机制研究进展