锌指蛋白36与系统性红斑狼疮相关性的分子流行病学研究

摘要

研究背景：
　　系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，对机体多器官、多系统产生损害，患者临床表现复杂，主要特征包括多种自身抗体产生、补体激活、免疫复合物沉积。其病因和发病机制目前仍未被完全阐明，大多数观点认为，遗传、环境和内分泌等因素之间的相互作用引起机体免疫系统紊乱，最终导致SLE的发生。
　　信使RNA(Messenger RNA，mRNA)衰变是控制许多炎症相关基因表达的一个关键机制。既往研究指出，多种与炎症有关的基因mRNA的3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）富含AU重复序列（AU-rich element, ARE）。细胞中存在一类蛋白与mRNA有高度亲和性，可以通过与ARE结合从而调节mRNA的稳定性，这类蛋白被称为RNA结合蛋白。锌指蛋白36（Tristetraprolin, TTP）是最常见的一种RNA结合蛋白，又名ZFP36，TIS11，NUP475，GOS24。研究表明，TTP可以与多种靶基因mRNA的ARE结合，调节mRNA的稳定性及蛋白质的表达，如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白细胞介素6（Interleukin6, IL-6）和IL-10等。有研究发现TTP可通过阻滞核转录因子κB(Nuclear factorκB, NF-κB)/p65细胞核移位从而抑制NF-κB的活性。还有研究表明TTP与组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases, HDACs）间的相互作用，能够负向调节NF-κB信号传导通路。上述研究表明TTP不仅能够通过导致mRNA衰变来调节炎症细胞因子的表达，而且在炎症信号转导方面也具有潜在的调节作用。
　　辅助性T细胞17(Th17)是新近发现的一种Th细胞亚型，以分泌IL-17为主，因此命名为Th17细胞。除分泌IL-17外，Th17还可分泌IL-21、IL-22等细胞因子。大量研究表明，Th17细胞及其相关细胞因子参与了SLE的发病。TTP敲除小鼠的骨髓诱导的树突状细胞（Bone marrow-induced dendritic cells, BMDCs）中，IL-17、IL-23p19和IL-23表达显著升高；在皮肤和淋巴结中，IL-17、IL-22、IL-23p19的表达显著升高，CD4+IL-17+T细胞和CD4+IL-22+T细胞百分比也显著升高。此外，TTP敲除小鼠表现出严重的炎症性表现，如关节炎、皮炎。该研究提示TTP能促进IL-23p19 mRNA的降解进而调节IL-23的产生，且TTP敲除小鼠表现出的临床和免疫学异常与IL-23/Th17轴有关。人T细胞株HuT102转入TTP后，IL-17表达显著下调，相反，Jurkat细胞株转入TTP-siRNA后，IL-17表达上调。此外，研究发现TTP能够直接结合到IL-17和IL-22 mRNA的ARE位点，破坏mRNA的稳定性，从而介导IL-17和IL-22表达下调。TTP缺陷小鼠出现不完整脱发、关节炎、皮炎、结膜炎，肾小球系膜增厚等症状，同时抗核抗体（Antinuclear antibody，ANA）、抗单链DNA（Single strain DNA，ssDNA）抗体、抗双链DNA（Double strain DNA，dsDNA）抗体在TTP缺陷小鼠血清中升高。一项针对NZB/W型狼疮鼠来源的肾小球系膜细胞的研究表明，调节TTP的表达可能对IL-6的产生和SLE肾小球系膜细胞增生具有潜在影响。
　　大量研究表明，TTP在癌症、感染、代谢综合征等炎症性疾病的发展过程中起重要作用。而针对TTP在自身免疫性疾病中所起的作用的研究较少。已有文献报道TTP与类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）发病和严重程度相关。它是否也参与SLE的发病尚不清楚。因此，鉴于以上理论基础，本研究拟开展TTP与SLE发病相关性的分子流行病学研究。收集 SLE患者和正常对照，采用 TaqMan基因分型方法，分析TTP基因多态性与SLE遗传易感性的关系；采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术，检测SLE患者与正常对照、活动期SLE患者与非活动期SLE患者、狼疮肾炎（Lupus nephritis，LN）患者与非肾炎患者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中TTP基因mRNA表达水平的差异，并分析TTP基因mRNA表达水平与SLE疾病活动度、临床特征和实验室指标的关联。采用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测SLE患者血浆中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和 IL-23的表达水平，并分析 PBMC中 TTP基因 mRNA表达水平与血浆 TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23水平的关联；采用蛋白质印迹法（Western blot）检测SLE患者与正常对照、LN患者与非LN患者、活动期SLE患者与非活动期SLE患者的外周血CD4+T细胞中TTP蛋白表达水平的差异，分析TTP蛋白表达水平与SLE疾病活动度、临床特征和实验室指标之间的关联情况，以期为发现新的生物标记物提供参考，进而为SLE的诊断和临床治疗提供依据。本研究分为三个部分。
　　第一部分：TTP基因多态性与SLE遗传易感性的相关性研究
　　目的：比较SLE患者和正常对照之间，LN患者与非LN患者之间TTP基因（rs251864和rs3746083）的等位基因和基因型频率分布间的差异，探讨TTP基因多态性与中国汉族人群SLE遗传易感性关联。并结合临床资料，探讨 TTP基因（rs251864和rs3746083）与临床表现间的关系。
　　方法：本次研究共收集SLE患者1167例，患者全部来源于安徽医科大学第一附属医院和安徽省立医院风湿免疫科。所有患者均符合1997年美国风湿病协会（American College Rheumatology，ACR）修订的SLE分类标准。1194例正常对照来自两所三甲医院健康体检中心以及安徽医科大学在校学生。经研究对象知情同意后，抽取5ml外周静脉血，收集 SLE患者的一般情况和主要临床特征资料，并提取 DNA，采用 TaqMan技术进行基因分型。统计分析采用 SPSS19.0软件。检验水准α=0.05。
　　结果：（1）哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验 TTP基因rs251864和rs3746083两个位点的基因型分布在病例组和对照组中均达到遗传平衡（P>0.05）。
　　（2）TTP基因 rs251864位点多态性与 SLE的关联性研究 rs251864位点等位基因频率在病例组和对照组间差异无统计学意义（G vs. A:χ2=1.091, P=0.296）。基因型频率在病例组和对照组间差异无统计学意义（GG vs. AA:χ2=1.077, P=0.299,OR=1.188,95%CI:0.8580-1.646; AG vs. AA:χ2=0.007, P=0.931, OR=0.992,95%CI:0.833-1.182）。此外，显性模型和隐性模型的病例组和对照组分布也均未发现统计学差异（GG+GA vs. AA:χ2=0.124, P=0.725, OR=1.030,95%CI:0.873-1.216;GG vs. GA+AA:χ2=1.175, P=0.278, OR=1.192,95%CI:0.868-1.638）。LN患者与非LN患者等位基因和基因型频率分布间的差异均无统计学意义（P>0.05）。结果显示 rs251864位点与口腔溃疡存在统计学关联（χ2=4.367, P=0.037）。
　　（3）TTP基因 rs3746083位点多态性与 SLE的关联性研究 rs3746083位点T等位基因在病例组中有降低的趋势，但差异并未达到统计学意义（T vs. C:χ2=3.310, P=0.069, OR=0.749,95%CI:0.548-1.024）。基因型频率在病例组和对照组间差异无统计学意义（TT vs. CC:χ2=0.013, P=0.908, OR=1.093,95%CI:0.241-4.963;CT vs. CC:χ2=2.761, P=0.097, OR=1.335,95%CI:0.949-1.878）。无论是显性模型还是隐性模型，病例组与对照组间分布均未发现统计学差异（TT+TC vs. CC:χ2=2.940, P=0.086, OR=1.337,95%CI:0.959-1.865;TT vs. TC+CC:χ2=0.008, P=0.929, OR=1.071,95%CI:0.234-4.899）。LN患者与非LN患者等位基因和基因型频率分布间的差异均无统计学意义（P>0.05）。结果显示 rs3746083位点与SLE主要临床特征之间没有关联（P>0.05）。
　　结论：本研究表明在中国汉族人群中TTP基因rs251864和rs3746083位点多态性与SLE的易感性无关，rs251864位点多态性可能与SLE患者合并口腔溃疡有关。
　　第二部分：SLE患者PBMC中TTP基因mRNA表达水平及其与血浆TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23细胞因子的关联性研究
　　目的：比较SLE患者与正常对照、LN患者与非LN患者、活动期SLE患者与非活动期SLE患者的 PBMC中TTP基因mRNA表达水平及与血浆中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的关联性。
　　方法：42例 SLE患者来源于研究一。40例正常对照来源于合肥市中心血站健康献血者和安徽医科大学学生。采用现有资料和问卷调查相结合的方法收集SLE患者和正常对照相关信息，进行SLE疾病活动指数（SLE disease activity index, SLEDAI）评分，并抽取5 ml外周静脉血，利用密度梯度离心法分离PBMC。利用trizol提取PBMC中的RNA。RT-PCR方法检测42例SLE患者和40例健康对照PBMC中TTP基因mRNA表达水平。ELISA方法检测42例SLE患者血浆中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平。采用 SPSS19.0软件进行统计分析。检验水准α=0.05。
　　结果：（1）各组间PBMC中 TTP基因mRNA表达水平比较： SLE患者与正常对照PBMC中TTP基因mRNA表达水平无统计学差异（Z=-1.299, P=0.194），活动期SLE患者PBMC中TTP基因mRNA表达水平与非活动期SLE患者相比有降低的趋势，但没有达到统计学意义（Z=-1.693, P=0.090），LN患者PBMC中TTP基因mRNA表达水平低于非LN患者（Z=-2.695, P=0.007）。
　　（2）SLE患者 PBMC中 TTP基因mRNA表达水平与主要临床特征和实验室指标的关系：SLE患者 PBMC中 TTP基因mRNA表达水平与蛋白尿和抗-dsDNA抗体有关（Z=-2.323, P=0.020;Z=-2.299, P=0.022）。
　　（3）SLE患者 PBMC中 TTP基因 mRNA表达水平与 SLEDAI相关性分析：Spearman等级相关分析结果显示，SLE患者 PBMC中 TTP基因mRNA水平与SLEDAI评分有负相关趋势，但没有达到统计学意义（rs=-0.293, P=0.060）。
　　（4）SLE患者各组间血浆TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平比较：LN患者与非LN患者血浆IL-17差异有统计学意义（t=2.132，P=0.039），未发现疾病活动组与非活动组间TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23表达水平的差异（P>0.05）。
　　（5）SLE患者血浆TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平与主要临床特征和实验室检测指标的关联：研究发现在有胸膜炎的SLE患者血浆中TNF-α和IL-17水平显著升高（t=2.346, P=0.024;t=2.102, P=0.042），在白细胞降低的SLE患者血浆中TNF-α、IL-17、IL-21和IL-22水平显著升高（t=2.314, P=0.026;t=2.232, P=0.031;t=3.140, P=0.003;t=2.229, P=0.031），未发现血浆IL-6、IL-10和IL-23水平与SLE患者的临床和实验室特征之间存在关联（P>0.05）。
　　（6）SLE患者血浆TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平与SLEDAI相关性分析：SLE患者血浆中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23水平与 SLEDAI评分之间无明显相关性（P>0.05）。
　　（7）SLE患者PBMC中TTP基因mRNA表达水平与血浆中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23水平的相关性：SLE患者中TTP基因mRNA表达水平与血浆TNF-α水平呈负相关（rs=-0.316, P=0.042），与血浆IL-17水平呈负相关（rs=-0.338, P=0.029），未发现SLE患者TTP基因mRNA表达水平与IL-6、IL-10、IL-21、IL-22和IL-23水平的相关性（P>0.05）。
　　（8）TTP基因多态性与TTP基因mRNA水平的关系：未发现rs251864、rs3746083与TTP的mRNA表达水平之间的关联（P>0.05）。
　　结论：本研究发现SLE患者与正常对照PBMC中TTP mRNA表达水平无统计学差异，活动期SLE患者与非活动期SLE患者相比TTP mRNA表达水平无统计学差异，SLE合并LN患者PBMC中TTP基因mRNA表达水平低于非LN患者。SLE患者 TTP基因 mRNA表达水平与蛋白尿和抗 dsDNA抗体阳性有关。SLE患者TTP基因 mRNA表达水平与血浆TNF-α、IL-17水平呈负相关。SLEDAI评分与TTP基因mRNA表达水平无明显相关性。未发现TTP基因rs251864、rs3746083位点多态性与mRNA水平的关联。
　　第三部分：SLE患者外周血CD4+T细胞中TTP表达水平与SLE的相关性研究
　　目的：比较SLE患者与正常对照、LN患者与非LN患者以及活动期SLE患者与非活动期SLE患者的外周血CD4+T细胞中TTP蛋白表达水平，分析其与SLE患者疾病活动度、临床特征和实验室指标之间的关联。
　　方法：25例SLE患者来自安徽省立医院和安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科。SLE患者均符合1997年ACR修订的 SLE分类标准。23例正常对照来自安徽医科大学教职工和学生。经研究对象知情同意后，抽取20ml外周静脉血，收集其一般情况资料和临床实验室资料，并进行 SLEDAI评分。利用密度梯度离心法分离PBMC，并应用免疫磁珠法进一步分选出 CD4+T淋巴细胞，然后应用流式细胞术检测免疫磁珠法分选前后CD4+T淋巴细胞的纯度，接着应用Western blot技术检测CD4+T淋巴细胞中TTP的蛋白表达情况。采用 SPSS19.0软件进行统计分析。检验水准α=0.05。
　　结果：经流式细胞仪检测发现，与分选前的纯度相比，应用免疫磁珠法分选后的CD4+T淋巴细胞纯度高达95%以上。
　　（1）CD+T细胞中TTP蛋白表达水平比较： SLE患者与正常对照之间CD4+T细胞中TTP蛋白表达水平无统计学意义(Z=-1.249, P=0.212)，活动期SLE患者与非活动期SLE患者、LN患者与非LN患者相比外周血CD4+T细胞中TTP蛋白表达水平均有降低的趋势，但没有达到统计学意义（Z=-1.654, P=0.098; Z=-1.689, P=0.091）。
　　（2）CD+T细胞中TTP蛋白表达水平与主要临床特征和实验室指标的关系：分析结果显示，TTP蛋白表达水平与发热有关（Z=-2.272, P=0.023）。未发现TTP蛋白表达水平与其他临床特征和实验室指标之间的关联。
　　（3）CD+T细胞中TTP蛋白表达水平与SLEDAI相关性分析：Spearman等级相关分析结果显示，SLE患者 PBMC中 TTP蛋白表达水平与 SLEDAI评分之间无相关性（rs=-0.132, P=0.528）。
　　结论：本研究发现SLE患者与正常对照、活动期SLE患者与非活动期SLE患者、LN患者与非LN患者之间外周血CD4+T细胞中TTP蛋白表达水平均无统计学差异，SLE患者外周血CD4+T细胞中TTP蛋白表达水平与发热这一常见临床特征存在关联。SLEDAI评分与TTP蛋白表达水平无明显相关性。

目录

声明

英文缩略词Abbreviation

第一部分 TTP基因多态性与SLE遗传易感性的相关性研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二部分 SLE 患者 PBMC 中 TTP 基因 mRNA 表达水平及其与血浆TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23细胞因子的关联性研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三部分 SLE患者外周血CD4+T细胞中TTP表达水平与SLE的相关性研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

结论

创新性及不足之处

下一步工作设想

参考文献

附录

致谢

综述:锌指蛋白36在炎症中的调节作用以及在疾病中的研究进展

附件一

附件二

附件三