鞘内吗啡预处理通过调控心肌缺血后脊髓神经元兴奋性发挥心肌保护作用的机制研究

摘要

背景与目的：
　　缺血性心脏病是我国目前致死率和致残率最高的疾病之一。虽然及时恢复缺血心肌血流灌注是治疗的重要手段，但心肌缺血后最终心肌梗死面积大约一半以上是由缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）所致。心肌缺血再灌注过程中局部微环境产生的缓激肽、腺苷、氢离子等可兴奋心肌缺血敏感性传入神经元，并将伤害感受信号经背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）和相应节段脊髓上传至高级中枢。脊髓背角浅层尤其是脊髓背角II层又称胶状质SG（substantiagelatinosa,SG），是伤害性信息向中枢传递的初级门户，主要由兴奋性中间神经元组成，对伤害性刺激信息的传入与整合具有重要的调控作用。心肌缺血引起相应节段脊髓神经元兴奋，进而通过交感反射释放神经递质加重心肌细胞损伤。因此，调控脊髓背角神经元兴奋性，抑制神经递质的释放，可能会减轻缺血性心肌损伤。本课题组前期的研究发现，鞘内吗啡预处理（intrathecal morphine preconditioning,ITMP）可明显减轻心肌缺血后损伤。然而，ITMP对远端心脏发挥保护作用的神经机制尚未阐明，本研究拟探讨ITMP对抗心肌IRI的神经信号调控机制。
　　方法：
　　SD雄性大鼠，体重180~280 g，成功建立鞘内置管模型。本实验分两个系列进行研究。第一部分：探讨ITMP对大鼠心肌缺血后脊髓SG神经元兴奋性的神经调控机制。实验随机分为6组（n=6），假手术组（SHAM组）、缺血再灌注组（IR组）、鞘内吗啡预处理组（ITMP组）、δ受体阻断剂NTD+ITMP组（NTD+ITMP组）、κ受体阻断剂 nor-BNI+ITMP组（nor-BNI+ITMP组）和μ受体阻断剂CTOP+ITMP组（CTOP+ITMP组）。所有组除SHAM组外均以结扎冠状动脉左前降支缺血30 min、再灌注120 min的方法建立心肌缺血再灌注损伤模型。ITMP组在心肌缺血前30 min经鞘内泵注吗啡（3μg·kg-1,10μl）5 min，停止5min，共3个循环；I/R组给予等容量生理盐水。NTD+ITMP组、nor-BNI+ITMP组以及CTOP+ITMP组分别于吗啡预处理前10 min鞘内分别注射NTD（1 ug·ul-1,10 ul）、nor-BNI（1 ug·ul-1,10 ul）、CTOP（1 ug·ul-1,10 ul）。于再灌注10 min结束时，急性分离大鼠 T2~T6脊髓，制备脊髓组织切片，采用全细胞膜片钳技术对大鼠 SG神经元进行动作电位（action potential,AP）记录，包括SG神经元静息电位（resting potential,RP）、动作电位阈值（threshold of action potential,APT）、动作电位峰值（peak of action potential,APP）、动作电位时程[用半峰时间（APD50）表示]，记录步阶电流40、60、80、100 pA诱发的动作电位个数。第二部分：研究ITMP对心肌缺血后损伤及相关神经递质释放的影响。实验分组以及动物模型建立同第一部分研究。实验过程中记录心律失常的发生率。于再灌注120 min时处死大鼠，取心肌组织，测定梗死区（IS）体积与缺血危险区（ARR）面积，计算IS/ARR比值；Western blot法检测T2~T6脊髓和DRG组织中c-fos蛋白表达；免疫荧光观察T2~T6脊髓背角P物质（substance P,SP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）和内吗啡肽2（endomorphin2,EM-2）的释放水平以及DRG中的SP和CGRP的表达情况。
　　结果：
　　第一部分：探讨ITMP对大鼠心肌缺血后脊髓背角SG神经元兴奋性的神经调控机制
　　结果发现，心肌缺血后大鼠脊髓背角SG神经元兴奋性增强，表现为APT降低，APP增加，相同步阶电流刺激电流下诱发的AP个数增多；而ITMP显著逆转IR组大鼠SG神经元的兴奋性升高，表现为APT升高，APP降低，相同步阶电流刺激下诱发的AP个数减少。各组大鼠脊髓背角SG神经元RP和APD50差异无统计学意义。与ITMP组相比，通过预先分别给予δ、κ、μ三种阿片受体阻断剂可以取消SG神经元兴奋性的降低，表现为APT降低，APP增高，相同步阶刺激下诱发的AP个数增加。
　　第二部分：研究ITMP对心肌缺血后损伤及相关神经递质释放的影响
　　1.ITMP介导的大鼠心肌保护效应：ITMP可明显降低心肌梗死体积和心律失常发生率，且NTD、nor-BNI和CTOP完全阻断ITMP的心肌保护作用。
　　2.ITMP对大鼠心肌缺血后脊髓SP、CGRP和EM-2表达水平的影响：免疫荧光结果显示，SP、CGRP和EM-2免疫阳性产物在脊髓背角浅层存在共表达。心肌缺血后脊髓背角SP和CGRP大量表达，ITMP可以显著抑制心肌缺血后脊髓背角SP和CGRP的表达上调；EM-2在心肌缺血后脊髓背角的表达无明显变化，而ITMP可以显著上调心肌缺血后EM-2的表达。
　　3.ITMP对大鼠心肌缺血后DRG内SP和CGRP表达水平的影响：免疫荧光结果显示心肌缺血后，DRG内SP和CGRP表达均显著增加，ITMP可显著减少心肌缺血再灌注损伤诱导的DRG内SP和CGRP的表达增加。
　　4.ITMP对大鼠心肌缺血后脊髓背角和DRG内c-fos表达的影响：Western blot结果证明，心肌缺血后大鼠脊髓背角和DRG内c-fos明显增多，ITMP可显著抑制心肌缺血后大鼠脊髓背角和DRG内c-fos表达的增多；三种中枢阿片受体阻断剂能取消ITMP的抑制效应。
　　结论：
　　ITMP对在体大鼠心肌缺血后损伤具有保护作用。其可能的神经调控机制：
　　1.ITMP心肌保护作用与降低心肌缺血后大鼠脊髓SG神经元的兴奋性，减轻心脏伤害感受反应，调控脊髓水平伤害感受信号有关，δ、κ、μ三种中枢阿片受体均参与了这种保护作用。
　　2.ITMP心肌保护作用与抑制心肌缺血后脊髓SP和CGRP等神经递质的过度释放，促进EM-2在脊髓水平的释放，降低神经元兴奋性有关。

目录

声明

英文缩略词表(Abbreviation)

1引言

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结果

3.1第一部分实验结果

3.2第二部分实验结果

4 讨论

4.1 ITMP对在体大鼠缺血后心肌损伤的影响

4.2 ITMP心肌保护作用的神经调控机制

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:中枢远端干预在心肌缺血再灌注中的保护作用的研究进展