转录因子NFIC在cAMP信号通路调控根尖牙乳头干细胞分化中的作用

摘要

目的：根尖牙乳头干细胞(Stem cells from apical papilla，SCAPs)是位于正在发育恒牙根尖部牙乳头组织中的间充质干细胞，对于形成根髓和牙根部牙本质具有重要作用。信号通路和转录因子在调控根尖牙乳头干细胞增殖、分化中具有重要作用。有研究表明，环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信号通路、核因子I-C（Nuclear factor I-C，NFIC）均能够促进SCAPs增殖及定向分化。本实验通过慢病毒转染过表达NFIC基因，研究转录因子NFIC在cAMP信号通路促进根尖牙乳头干细胞成牙/成骨分化中的作用，从而探讨转录因子NFIC、cAMP信号通路在调控SCAPs定向分化过程中可能的相互作用关系。
　　方法：收集牙根尚未发育完成的健康第三磨牙，采用酶消化法分离培养SCAPs。培养所得的细胞进行流式细胞术检测细胞表面特定抗原，茜素红染色及油红 O染色鉴定细胞成骨、成脂分化潜能。过表达NFIC慢病毒转染SCAPs细胞后，Western blot检测慢病毒转染效率。将SCAPs分别于普通矿化诱导液(对照组)、cAMP信号通路激动剂(Forskolin组)、转染空病毒载体协同Forskolin(Forskolin+LV-empty组)、转染过表达NFIC慢病毒协同Forskolin(Forskolin+ov-NFIC组)的矿化诱导液中培养。矿化诱导10天后茜素红染色检测各组矿化结节形成情况，并进行氯化烷基十六吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC）半定量分析。矿化诱导7天后，实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，QPCR）检测RUNX2，ALP和OCN的 mRNA表达情况。
　　结果：流式细胞术检测结果显示，SCAPs表达间充质干细胞相关表面标志物CD44，CD105和CD90，而造血干细胞特异性表面标记物CD45的表达较低。茜素红染色及油红 O染色检测发现细胞具有较强的成骨、成脂分化潜能。过表达 NFIC慢病毒转染SCAPs细胞后，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。Western blot检测慢病毒转染效率发现，转染过表达NFIC病毒的SCAPs细胞NFIC蛋白表达量高于空白对照组和阴性病毒对照组。实验各组细胞分别在成骨诱导液中矿化培养10天，进行茜素红染色后发现，各组均能形成矿化结节。与对照组相比，Forskolin作用SCAPs后矿化结节形成增多，染色加深；而Forskolin+ov-NFIC组较 Forskolin组镜下可见更多更密集的钙化结节，红染也更深，说明同时过表达NFIC基因后增强了Forskolin对SCAPs矿化结节形成能力的促进作用。矿化结节定量分析结果与茜素红染色结果一致，差异具有统计学意义。QPCR检测相关矿化标记物表达情况，结果显示Forskolin作用SCAPs后，RUNX2，ALP和OCN的mRNA表达较对照组均有不同程度升高；而 Forskolin+ov-NFIC组这些矿化基因的表达较 Forskolin组进一步上调，说明ov-NFIC基因与Forskolin具有协同作用。上述结果表明，转录因子NFIC能够增强Forskolin对SCAPs分化的促进作用。
　　结论：酶消化法培养所得的SCAPs检测表面抗原表达情况证实为间充质来源干细胞，且具有多向分化潜能。转录因子NFIC促进cAMP信号通路对SCAPs分化的调控作用。

目录

声明

中英文缩略词表

1 引言

1.1 SCAPs的特征

1.2 关于SCAPs的组织工程学研究

1.3 cAMP信号通路研究进展

1.4 cAMP信号通路在调控SCAPs增殖、分化中的作用

1.5 转录因子NFIC的研究进展

1.6 转录因子NFIC在调控SCAPs增殖、分化中的作用

2 材料与方法

2.1 主要材料及试剂

2.2 部分试剂配制方法

2.3 根尖牙乳头干细胞的分离、培养

2.4 根尖牙乳头干细胞的鉴定

2.5 过表达NFIC基因慢病毒转染SCAPs细胞

2.6 转录因子NFIC在cAMP信号通路调控SCAPs分化中的作用

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 人根尖牙乳头干细胞的体外培养

3.2 根尖牙乳头干细胞的鉴定

3.3 过表达NFIC基因慢病毒的鉴定

3.4 NFIC在Forskolin促进SCAPs矿化结节形成中的作用

3.5 NFIC在Forskolin促进SCAPs矿化基因表达中的作用

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:调控根尖牙乳头干细胞定向分化信号通路的研究进展