携带blaIMP和1型整合子的多个IncN2型质粒的测序和比较基因组学分析

摘要

碳青霉烯类抗生素是一类具有广谱抗菌活性的抗生素。它是治疗革兰阴性菌感染，特别是肠杆菌科菌的强效药物。近年来，耐碳青霉烯类抗生素的菌株逐渐增多，严重危及公众健康，已引发全球性关注。碳青霉烯酶可以水解碳青霉烯类抗生素。按照Ambler分类法，碳青霉烯酶可以分为A、B、D三类。其中A类和 D类酶均为丝氨酸酶，B类为金属酶。产碳青霉烯酶是菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因之一。
　　本研究的主要目的是探索三个产 IMP临床分离株耐药的分子机制。前期我们收集了大量菌株，通过各项基础筛查，最终选定3株深入研究：肺炎克雷伯菌0801、产酸克雷伯菌7121、弗氏柠檬酸杆菌17285。0801和7121（来自中国人民解放军307医院）分别分离自不同病人的血液和痰液标本，17285（来自安徽医科大学第一附属医院）分离自中段尿标本。菌株的菌种通过16S rRNA进行鉴定，PCR检测相应的耐药基因类型，碳青霉烯酶类型通过改良Carba NP法进行检测，利用VITEK2仪器测定菌株的抗生素敏感性，接合转移实验得到相应的接合子，进而验证质粒是否具有可转移性，用 Qiagen大提试剂盒从接合子中提取质粒DNA，构建mate-pair文库，通过Miseq仪器完成测序。
　　肺炎克雷伯菌0801、产酸克雷伯菌7121、弗氏柠檬酸杆菌17285均产IMP型碳青霉烯酶，blaIMP分别位于质粒p0801-IMP（登录号：KT345947）、p7121-IMP（登录号：KX784502）和 p17285-IMP（登录号：KX784503）上。这三个质粒均为接合型质粒，通过接合转移实验分别获得接合子0801-IMP-EC600、7121-IMP-EC600和17285-IMP-EC600。0801和7121携带的耐药基因均为blaIMP、blaTEM、和blaCTX-M-1group，17285携带的耐药基因为blaIMP、blaTEM。0801-IMP-EC600、7121-IMP-EC600和17285-IMP-EC600均仅含blaIMP。上述的所有野生株和接合子都产B类碳青霉烯酶，均对头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南耐药。0801、7121和17285对庆大霉素耐药，其他菌株均表现为敏感。所有菌株均对阿米卡星表现为敏感。
　　p0801-IMP、p7121-IMP和 p17285-IMP是首次完成全序测定的携带 blaIMP的 IncN2型质粒。本研究纳入分析的质粒共6个，IncN2型质粒的参考质粒pYNKP001-NDM，和5个包含1型整合子的IncN2型质粒（p0801-IMP、p7121-IMP、p17285-IMP、pJIE137和p34983-59.134kb）。比较基因组学分析显示，这6个质粒均可分为骨架区和外源插入区两大模块。其中5个包含1型整合子的 IncN2型质粒外源插入区的移动元件有：整合子In1223（p0801-IMP/p7121-IMP）、整合子In655（p17285-IMP）、整合子In27（pJIE137）、整合子In1130（p34983-59.134kb）、ISEcp1-orfRA1-14转座单元（p17285-IMP）、ISEcp1-blaCTX-M-62-Δorf477-orfRA1-14转座单元（pJIE137）和新型Tn1696相关转座子Tn6325（p34983-59.134kb）。In1223和In655均为Tn402-like1型整合子，In27和In1130为复合型1型整合子。IncN2型质粒通常会整合不同类型的移动元件，这些元件往往会携带耐药基因，多种耐药基因的共存势必会加速菌株的扩散及进化，所以医务工作者和相关部门应提高对耐药菌株传播的防控意识，规范临床抗生素的应用，预防或减缓耐药现象发生趋势。

目录

声明

缩略词

前言

1 肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌及细菌耐药现状

2 碳青霉烯酶简介

3 IMP研究进展

4 整合子

5 IncN型质粒

6 IncN型质粒中IMP研究现状

7 本研究的目的、意义

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 产碳青霉烯酶菌株的筛查与鉴定

3.2 相关实验菌株获得及其耐药表型与遗传背景分析

3.3 碳青霉烯耐药机制研究

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

主要试剂、溶液配制方法

个人简历

在学期间的研究成果目录

致谢

综述:IMP型金属β-内酰胺酶研究进展

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