急性髓系白血病T淋巴细胞亚型、相关细胞因子和转录因子分析及其与临床关联研究

摘要

目的：
　　检测急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者T淋巴细胞亚型CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8、NK细胞等比例，评估AML患者在不同病程阶段的细胞免疫功能差异；检测 AML患者、正常对照及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血浆白细胞介素（interleukin，IL）-12、干扰素（interferon，IFN）-γ和IL-10表达水平，以及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中转录因子T-box expressed in T cells（T-bet）、GATA binding protein3（GATA3）和Forkhead/winged helix transcription factor（FoxP3）基因mRNA表达水平；结合临床资料，分析IL-12、IFN-γ、IL-10及相关转录因子（T-bet、GATA3和 FoxP3）表达水平与 AML的临床特征及预后的关系；并探讨重组人白细胞介素2（recombinant human interleukin-2，rhIl-2）和重组人肿瘤坏死因子（recombinant human tumor-α，rhTNF-α）刺激对AML患者IL-12、IFN-γ、IL-10及相关转录因子（T-bet、GATA3和FoxP3）表达水平的影响。从而为进一步揭示AML的发病机制，探索新的治疗策略提供科学依据。
　　方法：
　　研究一：AML患者T淋巴细胞亚型的检测和临床意义分析
　　收集58例AML患者，65例对照组外周血，采用双色或三色直接免疫荧光素法标记细胞抗原，包括细胞膜表面和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD127、调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）及效应性T细胞（effector T cell，Teff）等，多参数流式细胞术检测T淋巴细胞亚型；
　　研究二：IL-12、IFN-γ、IL-10及转录因子（T-bet、GATA3及 FoxP3）在 AML患者中的表达及临床关联研究
　　收集30例AML患者、63例正常对照和27例SLE患者外周血样本，提取血浆及PBMC，采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血浆IL-12、IFN-γ和IL-10的表达水平；通过实时定量PCR法（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定PBMC中转录因子（T-bet、GATA3和FoxP3）表达水平；
　　研究三：IL-2和TNF-α对AML患者PBMC刺激的效应研究
　　收集30例AML患者外周血样本，提取PBMC。使用rhIL-2和rhTNF-α刺激PBMC后，采用ELISA测定上清液中IL-12、IFN-γ和IL-10水平，通过qRT-PCR测定PBMC中T-bet、GATA3和FoxP3的mRNA表达水平。
　　结果：
　　研究一：AML患者T淋巴细胞亚型的检测和临床意义分析
　　（1）全部AML初诊患者与正常对照、缓解组及复发组T淋巴细胞亚型检测结果比较：四组间CD3+T细胞、CD4+T细胞、Treg细胞、CD4/CD8及Treg/Teff细胞比例差异有统计学意义（均有P<0.05）；进一步两两比较发现：初诊AML组CD3+T细胞比例低于正常对照、缓解组及复发组（均有 P<0.05）；初诊组 CD4+T细胞比例分别低于对照组及缓解组；缓解组CD4/CD8比值高于正常对照组及复发组（均有 P<0.05）；复发组 Treg细胞比例高于初诊、缓解及正常对照组（均有P<0.05）；继发AML组NK细胞比例分别低于原发 AML组及正常对照组（均有P<0.05）；缓解AML组Treg/Teff比值大于正常对照组、AML复发及初诊组，复发AML组比值高于正常对照组（均有P<0.05）。
　　（2）AML初诊患者中，原发AML与继发AML患者T淋巴细胞亚型检测结果比较：原发AML患者CD4+T比例、Treg/Teff比例均高于继发AML患者（均有P<0.05），CD8+T细胞比例均低于继发 AML患者和正常对照（均有 P<0.05），而CD4/CD8比值则高于正常对照组和继发AML组（均有P<0.05）。继发AML患者CD4+T细胞比例、CD4/CD8比值均低于正常对照（均有P<0.05），而CD8+T细胞比例高于正常（P<0.05）。
　　研究二：相关细胞因子（IL-12、IFN-γ、IL-10）和转录因子（T-bet、GATA3、FoxP3）在AML患者中的表达及临床关联研究
　　（1）AML、SLE和正常对照血浆IL-12、IFN-γ及IL-10表达水平的比较：AML组IL-12、IFN-γ及IL-10表达水平均最低，SLE组IL-12、IFN-γ及IL-10表达水平均最高，三组间差异有统计学意义（均有P<0.05）；两两比较发现，AML组IL-12表达水平均低于正常对照组和SLE组（均有P<0.05）；AML组IFN-γ表达水平低于SLE组（P=0.002），SLE组IFN-γ表达水平高于正常对照组（P=0.003）；AML组IL-10表达水平低于正常对照组和SLE组（P=0.002；P<0.001）；SLE组IL-10表达水平高于正常对照组（P=0.040）。
　　（2）IL-10、IL-12与IFN-γ作为AML患者诊断指标的ROC曲线分析：IL-12与IFN-γ的ROC曲线面积差异无统计学意义（P=0.781），IL-12与IL-10的ROC曲线面积差异无统计学意义（P=0.637），IL-10与IFN-γ的ROC曲线面积差异无统计学意义（P=0.885）。
　　（3）AML患者、SLE患者与正常对照PBMC中T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA表达水平比较：AML组T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA的表达水平均最低，SLE组最高，三组间差异均有统计学意义（均有P<0.05）；两两比较发现，AML患者组T-bet基因mRNA的表达水平低于对照组和SLE组（均有P<0.05）；SLE组T-bet基因mRNA的表达水平高于对照组（P<0.001）；AML组FoxP3基因mRNA的表达水平低于SLE组（P<0.001），SLE组FoxP3基因mRNA的表达水平高于对照组，两组间差异有统计学意义（P<0.001）；AML组GATA3基因mRNA的表达水平均低于对照组和SLE组（均有P<0.05）。
　　组（均有P<0.05），SLE组T-bet/GATA3的水平高于正常对照组（P<0.001）。
　　（4）AML患者血浆IL-10、IL-12和PBMC中IFN-γ，T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA表达与主要临床特征的关系：除初诊白细胞>100×109/L患者的GATA3基因mRNA水平低于初诊白细胞<100×109患者外（P=0.040），其余各组的IL-10、IL-12、IFN-γ、T-bet、FoxP3和GATA3间差异均无统计学意义（均有P>0.05）。
　　乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）与细胞因子及转录因子之间的相关性分析：LDH与IL-10、IL-12呈正相关，相关系数rs分别为0.642（P=0.002）和0.662（P=0.001），与GATA3呈负相关（rs=-0.580, P=0.007）。
　　（5）AML、SLE患者IL-10、IL-12、IFN-γ、T-bet、FoxP3、GATA3的相关性分析：AML患者中 IFN-γ与 IL-10、IL-12呈正相关，相关系数 rs分别为0.766（P<0.001）和0.608（P<0.001）；IL-10与 IL-12呈正相关，相关系数 rs为0.719（P<0.001）；T-bet与FoxP3之间呈正相关，相关系数rs为0.383（P=0.037）。SLE患者：IFN-γ与IL-10、IL-12、T-bet和FoxP3均呈正相关，相关系数rs分别为0.473（P=0.013）、0.608（P=0.001）、0.408（P=0.035）和0.432（P=0.024）；IL-10与IL-12、T-bet和FoxP3均呈正相关，相关系数rs为0.444（P=0.020）、0.399（P=0.039）和0.488（P=0.010）；T-bet与 FoxP3、GATA3之间均呈正相关，相关系数 rs分别为0.383（P=0.037）、0.722（P<0.001）和0.529（P<0.001）。
　　研究三：IL-2、TNF-α对AML患者PBMC刺激的效应研究
　　（1）rhIL-2、rhTNF-α体外刺激对AML患者PBMC上清液中IL-12、IFN-γ和IL-10水平的影响：应用3种浓度的rhIL-2刺激后，IL-12、IFN-γ、IL-10表达均无显著改变（均有P>0.05）；3种浓度的rhTNF-α刺激，IL-12、IFN-γ、IL-10表达均无显著改变（均有P>0.05）。
　　（2）rhIL-2、rhTNF-?体外刺激对 AML患者 PBMC中 T-bet、FoxP3和GATA3mRNA水平的影响：rhIL-2刺激后，GATA3的mRNA表达无显著改变（P=0.326）；T-bet的mRNA表达有显著变化（P<0.001）；FoxP3的mRNA表达有显著变化（P=0.003）。
　　rhTNF-α刺激后，GATA3和 FoxP3的 mRNA表达均未发生显著改变（均有P>0.05）；但T-bet的mRNA表达有显著变化（P<0.001）。
　　结论：
　　初诊AML组免疫平衡向抑制性倾斜，继发AML组机体的免疫功能进一步受到抑制，进而出现CD4/CD8明显倒置，提示继发AML患者免疫功能受损更为严重。复发AML组Treg细胞比例高于初诊AML组、AML缓解组和正常对照组。AML患者血浆IL-12和IL-10及PBMC相关转录因子（T-bet、GATA3及FoxP3）表达水平均低于正常对照组和SLE组，表明AML患者体内出现了免疫抑制现象。同时发现rhIL-2的刺激可上调AML患者PBMC中T-bet和FoxP3的表达，rhTNF-?的刺激可上调AML患者PBMC中T-bet的表达。综上，AML患者存在细胞因子及转录因子表达异常，调节AML患者的免疫失衡状态可能有助于该病的治疗。

目录

声明

英文缩略词表

引言

研究一急性髓系白血病T淋巴细胞亚型的检测和临床意义分析

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

研究二 IL-12、IFN-γ、IL-10及转录因子（T-bet、GATA3及FoxP3）在AML患者中的表达及临床关联研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

研究三 IL-2、TNF-α对AML患者PBMC刺激的效应研究

1前言

2材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

本研究的不足之处及下一步工作展望

参考文献

致谢

综述:Numb Numb抑制 Notch信号通路对急性髓系白血病的影响