miR-21及其靶基因Sprouty1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究

摘要

在炎症性骨疾病中，骨形成能力受损是造成骨丢失的主要原因之一。提高骨形成能力是治疗这类疾病的关键问题。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是成骨细胞和骨细胞的前体细胞。在炎症性骨疾病如骨质疏松，类风湿性关节炎中，BMMSCs分化为成骨细胞的能力减弱可能导致骨形成障碍。因此，研究调控BMMSCs的成骨分化机制，提高骨髓间充质成骨分化能力对于治疗炎症性骨疾病具有重要意义。　　MicroRNAs(miRNA)是一类短小的非编码RNA，它们通过翻译后抑制或者降解靶基因的mRNA在细胞的多种生理病理过程中发挥重要的调控作用，例如细胞的增殖、分化、凋亡和癌症的发生进展。研究表明，miRNAs能够调控间充质干细胞和成骨细胞的成骨分化。本课题组前期结果和文献报道均表明，miR-21与人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)成骨分化以及绝经后骨质疏松相关，但miR-21是否调控了hBMMSCs的成骨分化，以及miR-21如何调控hBMMSCs的成骨分化，它们的表达和功能是否在绝经后骨质疏松环境中发生变化，目前还未知晓。研究miR-21对hBMMSCs成骨分化的调控作用以及在骨质疏松环境下表达和功能的异常，对于理解BMMSCs成骨分化的机制和开发治疗骨质疏松新的治疗策略具有重要意义。　　研究目的　　1.探讨miR-21在hBMMSCs成骨分化过程中的表达。　　2.探讨miR-21在hBMMSCs体外与体内成骨分化过程中的调控作用。　　3.探讨miR-21调控hBMMSCs成骨分化的分子机制。　　4.探讨miR-21在绝经后骨质疏松骨髓间充质干细胞（PMOP-hBMMSC）中表达和功能的异常。　　研究方法　　1.利用密度梯度离心和全骨髓贴壁相结合的方法分离培养hBMMSCs，流式细胞技术检测表面分子表达；克隆集落形成、MTT、细胞周期分析检测细胞增殖能力。成骨、成脂、成神经诱导检测hBMMSCs多向分化能力。RealtimeRT-PCR分析成骨成脂诱导后标志性基因的表达。　　2.利用RealtimeRT-PCR检测miR-21在hBMMSCs成骨分化中的表达变化。通过转染技术过表达或者抑制miR-21的表达，体外检测hBMMSCs成骨分化能力。ALP、茜素红染色观察碱性磷酸酶和钙化结节的表达。RealtimeRT-PCR和WesternBlot检测成骨标志性基因Runx2和Osterix的表达，并且将miR-21不同表达水平的hBMMSCs植入裸鼠皮下，8周后取材，固定后脱钙两周石蜡包埋切片，HE染色和Masson三色染色观测体内类骨质形成。　　3.生物信息学预测结合荧光素酶报告检测和WesternBlot蛋白分析，确定miR-21在hBMMSCs成骨分化中作用的主要靶基因Sprouty1(Spry1)。WesternBlot检测Spry1在成骨过程的表达。构建Spry1慢病毒表达载体，感染hBMMSCs。ALP、茜素红染色、RT-PCR和WesternBlot分析Spry1高表达后，hBMMSCs成骨能力的改变。　　4.分离培养正常人（H-hBMMSCs）和绝经后骨质疏松患者(PMOP-hBMMSCs)的骨髓间充质干细胞，并对两组细胞的成骨能力进行比较。RealtimeRT-PCR比较miR-21在两组细胞间的表达差异，同时检测两组hBMMSCs中Spry1基因和蛋白水平表达的差异。利用转染的方法上调PMOP-hBMMSCs中miR-21的水平，检测其成骨能力的改变及Spry1的表达变化。　　实验结果　　1.分离培养的hBMMSCs表达间充质表面标志物，而不表达造血系标志物。克隆集落和MTT结果显示hBMMSCs具有自我更新和复制的能力。成骨、成脂、成软骨诱导分化，证明培养的hBMMSCs具有多向分化能力。　　2.miR-21在hBMMSCs成骨过程中表达量升高。通过对miR-21的功能分析发现，高表达miR-21能够促进hBMMSCs体外成骨分化，并且也能够促进hBMMSCs体内异位成骨能力，而沉默miR-21能够抑制hBMMSCs体外成骨分化，降低hBMMSCs体内异位成骨能力。　　3.通过生物信息学预测的方法筛选出了miR-21的靶基因Spry1。荧光素酶报告检测和蛋白分析证明Spry1是miR-21的靶基因。通过对Spry1在成骨过程中表达谱分析发现Spry1在成骨过程中表达量下降而与miR-21在成骨分化中的表达相反。Spry1功能分析发现，上调Spry1能够抑制hBMMSCs的成骨分化。　　4.与H-hBMMSCs相比PMOP-hBMMSCs成骨能力明显减弱，而且miR-21表达下降，Spry1表达上升。通过转染miR-21，能够部分恢复PMOP-hBMMSCs的成骨分化能力，下调Spry1。　　结论：　　1.miR-21能够促进hBMMSCs的体外成骨分化能力。　　2.miR-21能够增强hBMMSCs体内异位成骨的能力。　　3.miR-21通过抑制其靶基因Spry1的表达来促进hBMMSCs的成骨分化。　　4.PMOP-hBMMSCs成骨能力减弱，miR-21-Spry1功能轴受到抑制。上调miR-21-Spry1功能轴，能够部分恢复PMOP-hBMMSCs的成骨分化能力。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、骨髓间充质干细胞与骨组织再生

二、BMMSCs 与骨疾病

三、MicroRNA

正文

第一部分 人骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化能力的鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 miR-21 调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的体外与体内研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 miR-21 靶基因的筛选及其功能验证

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 miR-21 在正常人和骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中的表达差异研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢