阿司匹林对大鼠破骨细胞分化成熟及RANK基因表达的影响

摘要

背景:骨重建的内稳态是由成骨细胞(Osteoblast,OB)的骨形成和破骨细胞(Osteoclast,OC)的骨吸收共同协调完成的,破骨细胞的异常增多常导致这种内稳态被打乱。破骨细胞的分化成熟依赖于核激活因子κB受体(ReceptorActivatorofNuclearFactor-κB,RANK,又称为TNFRSF11A)的配体(ReceptorActivatorofNuclearFactor-κBLigand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(MacrophageColony-StimulatingFactor,M-CSF)的作用。诱导破骨细胞形成的关键是由多种细胞因子介导的OPG/RANKL/RANK系统和RANK信号通路。代谢性、退行性和肿瘤性骨疾病或骨溶解都涉及到了OPG/RANKL/RANK系统,OPG/RANKL/RANK系统在破骨细胞形成中的核心作用使得RANK成为潜在治疗骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的核心靶点。　　本课题组前期研究发现小剂量的阿司匹林可以有效的使去势雌性大鼠骨质疏松模型的骨密度增加,提高骨的力学强度,改善骨小梁的三维结构和促进骨小梁的重建[1,2]。且在人骨髓间质干细胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSC)体外培养中发现低中浓度阿司匹林作用于骨髓基质干细胞可促进其骨向分化和成骨细胞特性表达,表明阿司匹林有促进骨代谢合成的作用[3],然而其防治绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PMOP)发病的分子机制尚不明了,文献报道可能与绝经后失去雌激素的保护、破骨细胞激活而进入骨的高代谢状态有关[4],阿司匹林是否通过该途径而发挥抗绝经后骨质疏松作用?这正是本研究希望阐明的问题。　　目的:研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞的分化成熟及RANK基因表达水平的影响,以探讨阿司匹林防治绝经后骨质疏松症可能的分子机制,从而为阿司匹林创新应用于防治绝经后骨质疏松症提供全新的理论依据。　　方法:(1)建立由可溶性核激活因子κB受体的配体(solubleReceptorActivatorofNuclearFactor-κBLigand,sRANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(MacrophageColony-StimulatingFactor,M-CSF)共同作用的大鼠破骨细胞原代诱导培养体系。(2)实验分为6组:A组正常对照组;B组雌激素组(17β-雌二醇10-6mmol/L);不同浓度的阿司匹林组(C组0.25mmol/L、D组0.5mmol/L、E组1.0mmol/L、F组1.5mmol/L)。(3)诱导培养后于不同时间点对各组破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-ResistantAcidPhosphatase,TRAP)染色,观察细胞形态,并计数破骨细胞数量。(4)将各组破骨细胞接种于骨磨片上,建立破骨细胞-骨磨片活性分析模型,于不同时间点对骨磨片进行光镜和扫描电镜观察,分析计算骨吸收陷窝面积比例。(5)RT-PCR技术检测破骨细胞RANK基因mRNA的表达。(6)ELISA法检测破骨细胞RANK蛋白分泌表达情况。　　结果:(1)与正常对照组相比,雌激素组和各阿司匹林实验组的破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积均低于正常对照组,差异有显著统计学意义(P<0.05);且随着阿司匹林浓度的增加,阿司匹林组TRAP阳性多核破骨细胞数量、骨吸收陷窝面积逐渐减少直至消失,组间差异亦有显著差异(P<0.05)。低浓度阿司匹林组(0.25mmol/L)与雌激素组相比没有明显差异;但中、高浓度阿司匹林实验组(0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L)破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积减少,与雌激素组有显著统计学差异(P<0.05)。　　(2)RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,雌激素组和阿司匹林各组均可抑制破骨细胞RANK基因表达,且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性(P<0.05)。　　(3)ELISA结果显示,与正常对照组相比,雌激素组和阿司匹林各组均可抑制破骨细胞RANK蛋白表达水平,且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性(P<0.05)。　　结论:阿司匹林具有体外抑制大鼠破骨细胞RANK基因和蛋白表达的作用,也可以抑制破骨细胞的分化成熟及骨吸收功能,且具有剂量依赖性,这可能是阿司匹林通过抑制破骨细胞而具有抗骨质疏松作用的关键分子机制。该研究结果为阿司匹林这一老药创新应用于绝经后骨质疏松的治疗提供了理论依据。

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实验一 阿司匹林对大鼠破骨细胞分化成熟和骨吸收活性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 阿司匹林对大鼠破骨细胞 RANK mRNA 及蛋白质表达的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢