乌龟冬眠和非冬眠期线粒体转录组的表达分析及其ND3基因编辑的研究

摘要

在冬季，许多动物会采用冬眠的策略应对冷环境和食物来源不足，通过这种方式可以节省90％的能量。动物冬眠时通常会伴随代谢速率下降、体温降低、心跳速率减慢及呼吸频率下降等生理现象，是对不良生存条件的一种积极应答。冬眠期动物代谢速率降低虽然与低温有关，但更多是受有机体积极调控影响的结果，主要涉及能量的生成与消耗两个方面，一些耗能反应，如转录的起始、延伸、蛋白质的合成、离子泵对离子的运输等过程在冬眠期都受到抑制，而能量生成减少则主要与线粒体呼吸受抑制有关。
　　本研究采用Thermo公司的线粒体分离试剂盒，从6只乌龟（冬眠2♀，1♂；非冬眠期3♀）的心脏组织和肝脏组织中分离线粒体，并用RNA提取试剂盒从线粒体中提取RNA，构建cDNA文库，利用Illumina Hiseq2500，对12个样本进行了高通量测序，利用 Cuffdiff程序筛选样本组 liver1、2、3（冬眠期）与样本组liver4、5、6（非冬眠期）、heart1、2、3（冬眠期）与样本组heart4、5、6（非冬眠期）差异表达的转录本。
　　结果显示：在肝脏组织中，冬眠期表达量下调的线粒体基因共10个，包括7个蛋白编码基因（P<0.01）：ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、Cytb、ATP6，下降范围为6％—72％；2个tRNA基因（P<0.05）：tRNA-Ala和tRNA-Leu(UUA)分别下降19％和69％；1个rRNA基因（P<0.01）：16S rRNA，下降28％。冬眠期肝脏组织中表达量上调的线粒体编码基因共7个（P≤0.01），包括2个蛋白编码基因：COX2、COX3，分别上升17％和48％；4个 tRNA基因：tRNA-Cys、tRNA-Ser(UCA)、tRNA-Trp、tRNA-Asn，上升范围为13％-107％；1个rRNA基因：12SrRNA上升68％。在冬眠期乌龟的心脏组织中线粒体编码基因表达量下调的有8个蛋白编码基因（ND4L的P值为0.035，其余P均小于0.01）：ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、Cyt b、ATP6，下降范围18％—67％；2个tRNA基因（（P<0.05））：tRNA-Ala和tRNA-Thr，分别下降2％和35％。冬眠期乌龟心脏组织中，表达量上调的线粒体蛋白编码基因只有COX2（P<0.01），上升38％；表达量上调的tRNA基因有6个（P<0.05）：tRNA-Cy、tRNA-Asp、tRNA-Pro、tRNA-Ser(UCA)、tRNA-Trp、tRNA-Phe，上升范围9％—124％；另外12SrRNA（P<0.01）的表达量也上调，上升38％。实验结果表明：
　　（1）与非冬眠期相比，乌龟在冬眠期，肝脏组织与心脏组织中大部分线粒体蛋白编码基因的表达量下调，此可能与冬眠期线粒体呼吸链复合体活性下降、数量降低以及底物氧化受阻等有关，它们共同调节线粒体的呼吸速率。
　　（2）COX2、COX3的表达量上调可能有利于维持复合体Ⅳ与低浓度氧气结合的效率，使乌龟能在 O2浓度较低的情况下维持氧化磷酸化过程，推测可能与阻止或限制由缺血/灌注或寒冷对复合体Ⅳ造成的损伤。
　　（3）COX3基因在心脏中表达差异不显著，而在肝脏中表达量上调，这可能与心脏、肝脏的功能相关，因为心脏主要负责维持血液循环，而肝脏是有机物彻底氧化分解的主要器官。
　　前人对乌龟线粒体基因组测序显示，其ND3基因存在174位单核苷酸A的插入现象，为研究其转录、表达机制，本研究采用RT-PCR的方法，获得了乌龟心脏和肝脏组织线粒体中ND3基因的cDNA序列，并用Clustal X2.0.11软件将获得的cDNA序列与上传至NCBI上的乌龟ND3基因序列进行比对，通过分析发现，在cDNA序列的174位点仍然为单个A碱基的插入，这不仅证实乌龟的ND3基因存在单核苷酸插入现象，也表明在 mRNA转录后的加工过程中，该插入碱基并没有被删除掉，它参与了ND3蛋白的翻译过程。通过比对已测序的龟鳖物种线粒体ND3基因序列，发现在61个龟鳖物种中，有46个物种有ND3单核苷酸插入现象，它们在插入位点附近存在一个保守序列框CTN A* GTAGCA（A*为插入），除乌龟外，其它物种该框中的N为G、T或C。但乌龟此处的序列框为CTA A* GTA GCAR，即N为A。一个有趣的现象是，乌龟线粒体基因组此处的A转录为T，由T→A的转换，可能是通过RNA的编辑形成的。这是第一次发现ND3基因存在RNA编辑的现象，此进一步显示该保守序列框对核糖体识别插入碱基是十分重要的。

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第一部分 文献综述

第一章 冬眠和非冬眠期动物线粒体代谢的研究进展

1.线粒体在细胞能量代谢中的功能

2.冬眠期动物在能量消耗代谢上受抑制

3.线粒体在冬眠期细胞代谢中的作用

4.冬眠期和非冬眠期线粒体基因组的表达研究

5.本研究的目的与意义

第二部分 研究论文

第二章 乌龟冬眠和非冬眠期线粒体转录组的比较研究

1. 材料与方法

2.实验结果

3.讨论

第三章 乌龟线粒体基因组ND3基因174位点A插入及

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

参考文献

致谢