白介素-10对TGFβ<,1>诱导的大鼠肝星状细胞表达CTGF及TIMP-1的影响

摘要

目的：肝纤维化(HF)是慢性肝病共有的病理改变，肝纤维化的进一步发展，可形成肝硬化，严重影响患者的健康与生命。肝星状细胞(HSC)在肝纤维化过程中起核心作用。转化生长因子β1(TGFβ1)是强有力的致纤维化的细胞因子，促进HSC增殖活化，合成大量ECM，在纤维化进程中起重要作用。白介素-10(IL-10)是一种炎症抑制因子，临床和动物实验表明，IL-10可减轻肝脏炎症，抑制肝纤维化的发展，可望发展为抗肝纤维化药物，但其作用机制尚未明确。本研究通过用IL-10及TGFβ1单独和共同干预体外培养的大鼠肝星状细胞系γ-HSC99，采用半定量RT-PCR法检测各组结缔组织生长因子(CTGF)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)mRNA表达，用免疫细胞化学染色法观察HSC表达α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)的变化，进一步探讨IL-10抗肝纤维化的作用机制。 材料与方法： 一、实验材料 1、γ-HSC99细胞系为活化的大鼠肝脏星状细胞。 2、实验试剂 TGFβ1及重组大鼠IL-10；逆转录试剂盒；Taq酶；引物；DMEM培养基；α-SMA一抗；SP试剂盒；DAB显色系统。 二、细胞培养 将γ-HSC99细胞复苏后接种于25cm2培养瓶中，每瓶加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、5％恒温CO2培养箱中，每1-2天以0.25％胰蛋白酶消化传代。 三、RT-PCR法检测 CTGF及TIMP-1 mRNA的表达用不同浓度的IL-10(10、20、40ug/L)与TGFβ1(8ug/L)单独和共同干预HSC 24、48、72h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，用分光光度法测定RNA含量及纯度。用RNA PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应，RT-PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳(100V，30 min)，用GDS凝胶成像系统拍摄电泳结果，各带用计算机图像分析系统扫描定量。 四、免疫细胞化学法检测α-SMA的表达 用IL-10(20ug/L)与TGFβ1(8ug/L)单独和共同干预HSC 24h后，采用免疫细胞化学染色法检测α-SMA的表达，在光镜下观察细胞爬片α-SMA的染色，应用图象分析仪器定性分析α-SMA的表达情况。 五、统计学分析数据 以均数±标准差表示，各组之间是否存在显著性差异分析采用One-wayANOVA分析，LSD-t检验。以P<0.05确定差异有无显著意义。 结果： 1、半定量RT-PCR法检测结果 产物经凝胶电泳可见分别于383 bp(CTGF)和335 bp(TIMP-1)处的清晰扩增条带。灰度分析结果显示：TGFβ1组与空白对照组(A组)比较，CTGF及TIMP-1mRNA表达均明显升高，差别有统计学意义(P<0.05)：IL-10各浓度组(C、D、E组)与空白对照组比较，基因表达差别无明显统计学意义(p>0.05)；同时加入TGFβ1及不同浓度的IL-10(F、G、H组)与TGFβ1组(B组)比较，CTGF及TIMP-1mRNA表达均明显降低，差别有统计学意义(P<0.05)，并且随着IL-10浓度的升高，抑制作用越明显。 2、免疫组化结果 DAB显色后，有棕褐色颗粒着色的细胞为阳性细胞，TGFβ1组阳性细胞数较空白对照组明显增多且染色颜色均偏深，故α-SMA的表达有所增加，IL-10单独干预HSC细胞与空白对照组比较差异不大，而TGFβ1及IL-10共同作用HSC细胞与TGFβ1组细胞相比，阳性细胞数较少且染色颜色较浅，故α-SMA的表达减少。 结论： 1、TGFβ1可诱导HSC进一步激活，表达α-SMA明显增多，并于基因水平显著促进HSC表达CTGF及TIMP-1mRNA。 2、IL-10单独干预，对HSC表达CTGF、TIMP-1mRNA及α-SMA无明显影响。 3、IL-10对TGFβ1诱导的HSC表达α-SMA及CTGF及TIMP-1mRNA有明显抑制作用。

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实验结果

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结论

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参考文献

综述肝星状细胞及相关细胞因子在肝纤维化形成中的作用

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