四种斑蝶的线粒体基因组全序列及其在蝶类系统发育研究中的意义

摘要

斑蝶亚科隶属于鳞翅目（Lepidoptera），蛱蝶科（Nymphalidae）。根据现有资料，全世界斑蝶亚科的种类共有12属300多种，主要分布在热带地区。目前，依据形态学、行为学以及基因序列数据等证据，有关斑蝶亚科在蝶类中的分类地位及其与其他类群间的系统发生关系还存在一些争议，因此还需要更多的形态学同源性状和分子数据来厘清这些问题。
　　本研究利用Long-PCR和primer-walking测定了斑蝶亚科4个代表种类（金斑蝶、绢斑蝶、拟旖斑蝶、青斑蝶）的线粒体基因组全序列，并分析它们的基因组成和变异特点；另外，以28种全变态类昆虫为外类群，基于线粒体基因组的2个rRNA基因序列数据，运用贝叶斯推论法和最大似然法构建了74种已测蝶类物种的系统发生树，探讨斑蝶亚科与蝴蝶各主要类群之间的系统发生关系；同时，基于化石记录资料，运用宽松分子钟方法推测了蝶类主要类群间的分歧时间。
　　结果显示：4种斑蝶的线粒体基因组结构与其他已测蝶类相同，都包括1个非编码的AT富集区，2个rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA），13个蛋白质编码基因（ND2，COI，COII，ATP8，ATP6，COIII，ND3，ND5，ND4，ND4L，ND6，Cytb，ND1）和22个tRNA基因。它们的线粒体全序列长度分别为15236 bp、15210 bp、15200 bp和15285 bp。
　　金斑蝶、绢斑蝶、拟旖斑蝶和青斑蝶线粒体基因组都包含基因间隔区和基因重叠区，它们的总长度分别为103 bp与33 bp、123 bp与32 bp、132 bp与37 bp和133 bp与36 bp。四种斑蝶的16S rRNA和12S rRNA基因的长度分别为1339 bp与783 bp、1311 bp与780 bp、1318 bp与786 bp和1352 bp与779bp；大多数tRNA基因二级结构是三叶草构型，但tRNASer(AGN)基因不具有二氢尿嘧啶臂，只形成了一个简单环。除COI基因（起始密码子为CGA），剩下的12个蛋白编码基因的起始密码子都是ATN；除COI、COII、ND5和ND4基因外（终止密码子为单独的T），剩余基因的终止密码子都是ATN。四种斑蝶的D-loop区分别长418 bp、443 bp、404 bp和438 bp，A+T含量分别为95.0％、93.2％、95.7％和93.4％。它们都含有一些单一的核苷酸重复序列以及微卫星重复序列，如poly(A)，poly(T)，(TA)n and(AT)n。
　　本研究所得的蝶类各科之间的系统发生关系为：（（（（灰蝶科+蚬蝶科）+蛱蝶科）+粉蝶科）+弄蝶科）+凤蝶科。蛱蝶科内部的系统发生关系为：（（（（（（（（蛱蝶亚科+苾蛱蝶亚科）+丝蛱蝶亚科）+闪蛱蝶亚科）+（线蛱蝶亚科+釉蛱蝶亚科））+喙蝶亚科）+眼蝶亚科）+绢蛱蝶亚科）+螯蛱蝶亚科）+斑蝶亚科。上述结果与之前基于多基因或线粒体蛋白编码基因重建的系统发生关系基本一致。谱系年代学分析结果显示，鳞翅目昆虫的分歧时间大约在侏罗纪（139.7 Ma；95％置信区间：120.1~160.9 Ma）；凤蝶科、粉蝶科、蛱蝶科和灰蝶科的分化时间在中生代的白垩纪，分别为85.7 Ma（64.5~107.1 Ma）、82.3 Ma（64.7~100.8 Ma）、78.7 Ma（63.2~95.6 Ma）和71.9 Ma（54.4~90 Ma），弄蝶科分化时间大约在新生代古新纪56.6 Ma（47.3~66 Ma）。

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第一章 蝶类系统分类学研究进展——兼论斑蝶亚科的系统发生地位

1.1形态学特征

1.1.1 蝶类的形态学特征

1.1.2斑蝶亚科形态学特征

1.2 蝶类的系统学研究

1.2.1 蝶类的形态分类学研究

1.2.2斑蝶亚科的形态学分类研究

1.2.3 蝶类的分子系统学研究

1.2.4 斑蝶亚科的分子系统学研究

1.3蝶类的谱系年代学研究

1.3.1蝶类的化石记录

1.3.2 谱系年代学研究

参考文献（References）:

第二章 金斑蝶、绢斑蝶、拟旖斑蝶、青斑蝶线粒体基因组全序列测定及比较分析

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 基因组DNA的提取

2.1.3 引物设计、PCR扩增、纯化与测序

2.1.4 数据处理与分析

2.2 结果与讨论

2.2.1 基因组成与结构

2.2.2 蛋白编码基因

2.2.3 转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）

2.2.4 A+T富集区（A+T-rich region）

参考文献（References）：

第三章 蝶类主要类群的系统学研究及谱系发育年代学分析——兼论斑蝶的系统发生地位

3.1研究材料和方法

3.1.1研究材料

3.1.2 序列处理

3.1.3系统进化树的构建

3.1.4化石校正点（calibrated fossils）的评估—交叉检验（cross alidation）

3.1.5分子钟的估算

3.2.结果与分析

3.2.1 序列变异分析

3.2.2蝶类主要类群的分子系统树

3.2.3 蝶类的系统学地位分析—兼论斑蝶亚科的系统学地位

3.2.4 蝶类谱系发育年代学分析

参考文献（References）:

致谢

附：读研期间论文发表情况及获奖情况