脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌网络损伤和针刺足三里、天枢穴修复作用的实验研究

摘要

背景：脾气虚证（Syndrome of Deficiency of Spleen-Qi，SDSQ）是临床上最常见的虚证之一，临床上主要是以进餐后胃部饱胀不适、消瘦乏力、倦怠易疲劳、面色枯黄无血色、大便稀溏等为临床表现。现代西方医学研究证实：脾气虚证的主要表现是胃肠道运动功能、消化吸收功能、内分泌功能和免疫功能等多系统、多因素的紊乱。然而消化道运动功能的恢复是消化吸收功能、内分泌和免疫功能低下等系统恢复的前提条件。胃肠道运动功能的恢复既是纠正胃肠道损害的最初始同时也是最关键的一步。促进胃肠道动力的治疗能够有效的治疗胃肠道运动功能、消化吸收功能、内分泌和免疫功能障碍等。所以说，探讨脾气虚证胃肠道运动功能障碍的本质，研究治疗脾气虚证胃肠道运动功能障碍的有效方法变得十分必要。针灸作为祖国医学中一种传统的治疗方法，在中国应用已有两千多年的历史。在临床实践中，越来越多的研究显示，针刺足三里、天枢穴可以纠正胃肠道运动功能紊乱，有效的治疗脾气虚证，在治疗功能性胃肠道疾病方面有着自己独特的优势，但确切的机制仍不十分清楚，需要进一步的研究。　　目的：通过苦寒泻下结合耗气破气的方法建造脾气虚证大鼠模型，以脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络为研究对象，观察脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络的损伤，研究脾气虚证的发病机制。然后对脾气虚证大鼠进行针刺足三里、天枢穴进行治疗，观察针灸对脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络损伤的修复作用，进一步探索针刺足三里、天枢穴治疗脾气虚证的作用机制。　　方法：选取清洁级成年 Wistar大鼠，雌雄不限，参考中国中医科学院陈小野教授的方法，先通过体质筛选，再采用苦寒泻下结合耗气破气的方法建造脾气虚证大鼠动物模型。将大鼠分为对照组、模型组、自然恢复组、假针刺穴位组（针刺非经非络穴位组）、针刺天枢穴治疗组、针刺足三里穴治疗组、针刺足三里+天枢穴联合治疗组。造模成功及治疗结束后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，打开腹腔切取小肠的近幽门端用于实验。本实验研究分为以下三部分：第一部分、通过观察一般行为学变化、监测体重、测定尿D-木糖排泄率、大体解剖观察、测定胃排空率、测定小肠推进率、病理学HE染色观察、透射电镜超微结构检测、免疫荧光标记激光扫描共聚焦显微镜检测等方法来观察脾气虚证大鼠小肠肠神经-ICC-平滑肌网络的形态学变化和针刺足三里、天枢穴的修复作用。第二部分、通过免疫荧光双重标记激光扫描共聚焦显微镜检测的方法来观察脾气虚证大鼠小肠肠神经-ICC之间的信号传导通路的损伤和针刺足三里、天枢穴的修复作用。第三部分、通过免疫组织化学、Westernblotting、qPCR等方法来观察脾气虚证大鼠小肠ICC-平滑肌之间的信号传导通路的损伤和针刺足三里、天枢穴的修复作用。通过三部分实验来探索脾气虚证所导致的胃肠道运动功能障碍的实质和针刺足三里、天枢穴治疗脾气虚证的作用机制。　　结果：　　1.与正常对照组相比，脾气虚证模型组大鼠的一般行为学表现明显变差，大体解剖肉眼观察小肠蠕动明显缓慢，小肠组织HE病理学表现小肠组织结构明显破坏，ICC的超微结构遭到严重破坏，体重增长明显缓慢，尿D-木糖排泄率、胃排空率、小肠推进率均明显降低，肠神经系统的PGP9.5神经纤维、ACh神经纤维、SP神经纤维、VIP神经纤维、NO神经纤维、ICC、SMC、ENS-ICC-SMC网络的数量明显减少，结构遭到明显破坏（P<0.05），而模型组、自然恢复组、假针刺组三组之间相互比较，无明显差异（P>0.05）。与模型组相比，天枢组、足三里组略有好转（P<0.05），但天枢组、足三里组两组之间比较，无明显差异（P>0.05）。与天枢组、足三里组相比，联合治疗组效果明显好转（P<0.05），但仍低于正常对照组（P<0.05）。总体来说，其基本趋势为：模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足三里组<联合组<正常组。　　2.与正常对照组相比，脾气虚证模型组大鼠小肠肠神经-ICC之间的信号传导通路，主要有ACh神经纤维的M受体、SP神经纤维的NK受体、NO神经纤维的受体-鸟苷酸环化酶（sGC）、VIP神经纤维的VPAC受体、PKA、PKC、cGK/PKG数量明显减少，其信号通路G蛋白偶联受体-cAMP-PKA途径、G蛋白偶联受体-磷脂酶C（PLC）-PKC途径、sGC-cGMP-PKG途径明显遭到破坏（P<0.05），而模型组、自然恢复组、假针刺组三组之间相互比较，无明显差异（P>0.05）。与模型组相比，天枢组、足三里组略有好转（P<0.05），但天枢组、足三里组两组之间比较，无明显差异（P>0.05）。与天枢组、足三里组相比，联合治疗组效果明显好转（P<0.05），但仍低于正常对照组（P<0.05）。总体来说，其基本趋势为：模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足三里组<联合组<正常组。　　3.与正常对照组相比，脾气虚证模型组大鼠小肠 ICC-平滑肌之间的信号传导通路，主要是缝隙连接和缝隙连接蛋白43数量明显减少，信号传导途径明显破坏（P<0.05），而模型组、自然恢复组、假针刺组三组之间相互比较，无明显差异（P>0.05）。与模型组相比，天枢组、足三里组略有好转（P<0.05），但天枢组、足三里组两组之间比较，无明显差异（P>0.05）。与天枢组、足三里组相比，联合治疗组效果明显好转（P<0.05），但仍低于正常对照组（P<0.05）。总体来说，其基本趋势为：模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足三里组<联合组<正常组。　　结论：　　1.脾气虚证时，大鼠一般行为学表现明显变差，体重增长缓慢，尿D-木糖排泄率明显降低，大体解剖观察小肠蠕动明显缓慢，胃排空率明显降低，小肠推进率明显降低，小肠病理学HE染色观察小肠组织结构明显破坏，ICC超微结构明显破坏，小肠的PGP9.5神经纤维、ACh神经纤维、SP神经纤维、NO神经纤维、VIP神经纤维、ICC、SMC数量明显减少，网络结构明显破坏。针刺足三里和天枢穴治疗后，可明显修复脾气虚证的损伤，其基本趋势为：模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足三里组<联合组<正常组。　　2.脾气虚证时，大鼠小肠肠神经-ICC之间的信号传导通路，主要有 ACh神经纤维的M受体、SP神经纤维的NK受体、NO神经纤维的受体-鸟苷酸环化酶（sGC）、VIP神经纤维的VPAC受体、PKA、PKC、cGK/PKG数量明显减少，其信号通路G蛋白偶联受体-cAMP-PKA途径、G蛋白偶联受体-磷脂酶C（PLC）-PKC途径、sGC-cGMP-PKG途径明显破坏。针刺足三里和天枢穴治疗后，可明显修复脾气虚证的损伤，其基本趋势为：模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足三里组<联合组<正常组。　　3.脾气虚证时，大鼠小肠 ICC-平滑肌之间的信号传导通路-缝隙连接、缝隙连接蛋白43的数量明显减少，信号传导途径明显破坏。针刺足三里和天枢穴治疗后，可明显修复脾气虚证的损伤，其基本趋势为：模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足三里组<联合组<正常组。

目录

声明

前言

第一部分脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌网络形态学损伤和针刺足三里、天枢穴修复作用的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞信号传导通路损伤和针刺足三里、天枢穴修复作用的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分脾气虚证大鼠小肠Cajal间质细胞-平滑肌信号传导通路损伤和针刺足三里、天枢穴修复作用的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:Cajal间质细胞的研究进展

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢